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犬瘟热(Canine distemper,CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)感染引起的犬及其他肉食动物的一种急性或亚急性、高度接触性传染性疾病,是我国当前对养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业危害最大的疫病之一。常规弱毒疫苗虽然在CD防控中发挥了非常重要的作用,但是也存在诸多缺点。加之犬瘟热病毒对流行因素的逐渐适应以及大量变异株的出现,全球范围内,犬瘟热的感染呈上升趋势,且其中有很多是免疫群体爆发犬瘟热的报道。因此,有必要寻求更加安全、有效的影响新型疫苗。本研究首先对Asia-1型犬瘟热病毒分离株(HLJ2-07株)优势保护性抗原基因-H蛋白基因进行了序列测定、遗传进化分析、真核表达和重组质粒DNA的小鼠免疫试验,初步验证其免疫原性。并在此基础上把H基因定向克隆入本实验室已构建完成的通用转移载体pUC-△E3-EGFP中,构建了含有犬瘟热病毒H基因的转移载体pUC-2△E3-H。对实验室已构建的表达绿色荧光蛋白的重组犬腺病毒2型rCAV-△E3-EGFP进行了蚀斑筛选、纯化和PCR鉴定,对纯化完全的病毒进一步进行了生物学特性分析(形态学鉴定、重组病毒与亲本毒株的病毒滴度比较、生长特性分析、遗传稳定性分析)。最后以转移载体pUC-2△E3-H转染rCAV-△E3-EGFP感染的COS-7细胞,经体内同源重组,获得了表达犬瘟热病毒H蛋白的重组犬腺病毒2型rCAV-2△E3-H。序列测定结果显示:H基因全长1824 bp,编码607个氨基酸,含有9个潜在的N-联糖基化位点和12个半胱氨酸残基。同源性分析表明:CDV HLJ2-07株与Onderstepoort、Convac疫苗株亲缘关系最远,核苷酸同源性仅为91.4%和91.3%;系统进化分析显示:HLJ2-07株属Asia-1型;与32株中国分离株比对,显示目前国内大部分分离株属于Asia-1型。由此,一方面说明,基因型的改变可能是H蛋白抗原性变化的一个重要原因。另一方面,显示出从国内主要流行株中选取合适毒株,构建疫苗的必要性和必需性。H蛋白的真核表达及免疫原性分析结果显示:pcDNA3.1-H免疫组血清可与感染已知HLJ2-07株病毒的MDCK-SLAM细胞发生特异性IPMA反应,染色后使细胞呈现阳性的棕红色,证明免疫动物后可产生抗CDV抗体;ELISA血清抗体滴度可达1:28～1:79;病毒中和抗体可达1:11～1:32,表明H蛋白具有免疫原性。重组病毒rCAV-△E3-EGFP的感染MDCK细胞后,待出现90%以上细胞病变时收获病毒,经数次蚀斑筛选和纯化,PCR鉴定,最终达到纯化完全,生物学特性研究显示,EGFP基因的插入和E3区的缺失不影响重组病毒的增殖特性,其毒力、生长特性与亲代病毒CAV-2相似,保持原有疫苗株的生长特性,且在MDCK细胞上连续传代25代遗传性状稳定,显示出一定得应用前景。基于重组病毒rCAV-△E3-EGFP,我们经构建好的转移载体pUC-2△E3-H经纯化后用脂质体法转染感染了rCAV-△E3-EGFP的COS-7细胞,病变明显时收毒,经蚀斑纯化和PCR鉴定,获得重组病毒rCAV-△E3-H。通过PCR、IFA鉴定,重组病毒能表达CDV H蛋白。本研究在对本室分离的犬瘟热病毒HLJ2-07株H基因进行了克隆及序列分析的基础上,进行了真核表达和免疫原性评估,纯化了表达EGFP基因的重组病毒rCAV-△E3-EGFP,并在此基础上成功构建了表达H蛋白的重组犬腺病毒2型载体,为下一步的重组腺病毒在遗传稳定性、生长动力学及试验免疫研究奠定基础。