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脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)可造成患者的终身瘫痪,给患者家属和社会带来沉重的负担,目前公认的治疗措施仅限于急性期大剂量的糖皮质激素和外科减压手术。神经干细胞的发现为脊髓损伤的治疗带来了希望,因为神经干细胞具有多分化潜能,可分化为神经元、少突胶质细胞等替代脊髓损伤后缺失的细胞成分。近年来,干细胞移植的研究取得了重大进展。然而,干细胞移植存在较多问题,如来源和伦理问题、长时间的体外扩增、潜在的致瘤危险性等。大剂量糖皮质激素治疗脊髓损伤方法的出现曾经被认为是脊髓损伤治疗史上的里程碑,但是随着广泛的应用于临床,出现了各种各样的问题,如各种并发症(主要为消化道出血)、高额的治疗费用以及要求严格的治疗时限,这些都限制了其进一步的广泛应用。维生素C是人体必不可缺的物质之一,对于人体的正常新陈代谢起着重要的作用,近年来的研究发现,维生素C在多种神经系统疾病的治疗中发挥中重要的作用,尤其是大剂量维生素C对于神经发育缺陷疾病有很好的治疗效果,本实验着眼于研究大剂量维生素C对于脊髓损伤修复的作用。由于脊髓损伤后损伤部位的轴突断裂,导致神经纤维的传导功能受损,从而造成损伤节段以下的感觉运动与自主神经功能丧失。具体表现为断裂轴突的远端变性、消失,轴突近端发生逆行性退变。脊髓损伤后发生一系列继发性损伤,造成损伤节段大量的细胞死亡以及轴突进行性变性坏死,而后形成的胶质瘢痕阻碍轴突的再生以及神经功能的恢复。然而,对脊髓损伤的深入观察指出,脊髓损伤后轴突的再生能力并没有丧失。断裂的轴突可向损伤区生长,但不能穿越损伤区并重新支配原有靶点。因此,如何使再生的轴突通过损伤区重新支配原有靶点,成为目前研究的重点。本课题组前期研制的神经支架材料具有定向的微管结构,一方面可以阻止瘢痕的长入,一方面为再生的轴突提供了定向微管结构,利于再生轴突到达远端目标,有利于脊髓损伤的恢复。骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)是一种多能干细胞,具备向终末组织细胞分化的能力,在组织工程研究中备受关注。骨髓基质干细胞相对于其他来源的干细胞,具有来源广泛,易于实现自体移植的特点,相对其他干细胞而言,骨髓基质干细胞具有广阔的临床应用前景,因此本研究选用骨髓基质干细胞作为种子细胞,复合新型支架材料修复脊髓损伤。第一部分大剂量维生素C治疗脊髓损伤的研究目的:明确大剂量维生素C对于脊髓损伤的治疗作用。方法:采用Impactor ModelⅠ型打击仪参照改良Allen’s法制作大鼠背侧ASCI模型,30只SD大鼠随机分为3组:第1组,对照组给予生理盐水;第2组,正常剂量维生素C组,自术后开始给予每天100mg/kg维生素C腹腔注射,持续4周;第3组,大剂量生素C组,剂量为每天200mg/kg维生素C。在术后7、14、21、28天,各组动物进行BBB评分以及足迹分析实验。术后28天处死动物,行HE染色进行组织学观察,测定损伤区空洞面积。结果:大剂量维生素C治疗组,行为学评价明显优于对照组,14天时,BBB评分,大剂量维生素C治疗组明显高于对照组(10.50±1.08 VS 7.10±0.86,P < 0.05),大剂量维生素C治疗组与正常剂量维生素C治疗组之间,以及正常剂量维生素C治疗组与对照组之间无明显差别(P > 0.05)。足迹分析实验,14天时步长,大剂量维生素C治疗组明显高于对照组(11.80±1.32 VS 10.11±0.95,P < 0.05),步宽,大剂量维生素C治疗组明显小于对照组(4.85±0.46 VS 5.63±0.38,P < 0.05),组织学观察,大剂量维生素C治疗组空洞面积明显小于对照组(2.56±0.21 VS 4.538±0.29,P < 0.01)。第二部分骨髓基质干细胞的培养目的:培养高纯度、具有分化能力的骨髓基质干细胞。方法:选用改良全骨髓贴壁培养法,进行BMSC向成骨细胞及脂肪细胞的诱导分化,进行BMSC表面抗原流式细胞术检测。结果:培养出生长稳定的BMSC。经相应的诱导剂诱导,可向成骨细胞及脂肪细胞分化,表现出成骨细胞及脂肪细胞的特性。经流式细胞术检测细胞表面抗原,结果显示为体积均一的细胞群,CD29、CD90、CD44分别表达为99.62%、99.75%、99.02%,CD45、CD34分别表达为2.40%、2.99%。第三部分新型支架材料复合骨髓基质干细胞修复脊髓损伤的研究目的:评价支架材料复合BMSC修脊髓损伤的有效性。方法:应用免疫组织化学及行为学测定等方法,从形态学和功能学两方面综合评价支架材料复合骨髓基质干细胞修复脊髓损伤的修复效果。结果:形态学观察结果显示:移植术后第12周,可见脊髓缺损区部分神经纤维连接形成,其中材料复合细胞组,再生神经纤维的数量和长度优于其他两组;损伤局部NGF阳性表达细胞数量,材料复合细胞组,明显多于其余两组,差别有统计学意义。行为学评价显示:支架材料复合细胞组优于其他两组,但是差别无统计学意义。