糖皮质激素影响肉仔鸡骨骼肌蛋白质合成的途径研究

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本研究利用外源导入糖皮质激素的方法,从体内和体外两个试验模型探讨糖皮质激素导致蛋白质合成发生改变的机制。体内试验中,研究了糖皮质激素对肉仔鸡胸肌蛋白质合成的影响,以及日粮氨基酸和能量对糖皮质激素调节效应的互作,初步探讨了糖皮质激素调控胸肌蛋白质合成的作用通路。此外,通过体外成肌细胞模型的建立,探索糖皮质激素对成肌细胞蛋白质合成的调控,并进一步验证糖皮质激素调控成肌细胞蛋白质合成的信号通路。开展了三个动物试验:试验一选取36日龄体重相近的AA雄性肉仔鸡,随机分两个处理,早晚各分别注射地塞米松(DEX,1mg/Kg BM)和相同体积的生理盐水,注射3天,38日龄20:00空腹12h后每个处理分别灌服亮氨酸(500mg/Kg BM)、葡萄糖(2.5ml/Kg BM)、两者混合液及生理盐水(5ml),结果发现糖皮质激素处理导致骨骼肌发育受阻,生产性能下降;糖皮质激素处理可使胸肌AMPKα2和IGF-I的mRNA表达水平显著降低,mTOR、Akt1、4E-BP1和S6K1mRNA的表达量显著升高;在糖皮质激素处理的条件下,灌服亮氨酸可显著降低胸肌IGF-1和4E-BP1的mRNA表达量。结果表明,糖皮质激素可通过AMPK和mTOR信号通路来影响胸肌蛋白质的合成。灌服亮氨酸或者葡萄糖对缓解糖皮质激素的作用不明显。试验二29日龄体重相近的AA雄性肉仔鸡随机分为两个组,分别饲喂亮氨酸日粮(1%)和丙氨酸日粮(0.68%),同时每个组早晚各分别注射DEX和相同体积的生理盐水,饲喂和注射4天,32日龄20:00空腹12h后采血采样,再饲喂3h后采血采样,结果表明,糖皮质激素可抑制骨骼肌发育,降低生产性能,可通过AMPK和mTOR信号通路来影响胸肌蛋白质的合成,并且饲喂亮氨酸日粮对蛋白质合成的抑制作用有一定的缓解效应。试验三34日龄体重相近的AA雄性肉仔鸡随机分为两个组,分别饲喂高能日粮(3612MJ/Kg)和基础日粮(3112MJ/Kg),同时每个组早晚各分别注射DEX和相同体积的生理盐水,饲喂和注射4天,37日龄20:00空腹12h后采血采样,再饲喂3h后采血采样,结果发现,空腹处理12h后,在饲喂高能日粮条件下,糖皮质激素处理激活了AMPKα2Thr172、mTOR Ser2448和p70S6K Thr389位点的磷酸化水平;在饲喂正常能量日粮条件下,糖皮质激素处理激活了mTOR Ser2448位点的磷酸化水平,抑制了p70S6K Thr389和Akt Ser473位点的磷酸化水平。空腹12h再饲喂3h处理后,在饲喂高能日粮条件下,糖皮质激素处理显著的抑制了mTOR Ser2448和p70S6K Thr389位点的磷酸化水平;在饲喂正常能量日粮条件下,糖皮质激素处理显著的抑制了mTOR Ser2448位点的磷酸化水平,显著的激活了AMPKα2Thr172和p70S6KThr389位点的磷酸化水平。结果表明,糖皮质激素可通过AMPK和mTOR信号通路来影响胸肌蛋白质的合成,糖皮质激素一方面可能通过mTOR来影响p70S6K,另一方面也可能不通过mTOR,而通过其它路径来影响p70S6K。利用体外培养成肌细胞,开展了三个体外试验:试验四可分为:对照组,DEX(40nM)组,DEX和PI3K抑制剂(10μM LY294002)共同处理,DEX和Akt抑制剂(10μMAktinhibitor)共同处理组,DEX和mTOR抑制剂(25μM Rapamycin)共同处理,处理3h后发现,糖皮质激素处理显著的抑制了GR、mTOR、S6K1、AMPKα2、Akt1的mRNA表达;糖皮质激素和PI3K/Akt抑制剂共同处理可显著的降低Akt1、S6K1和AMPKα2的mRNA表达,可使mTOR的mRNA表达显著降低或有下降趋势。试验五可分为:对照组,DEX(1μM)组,DEX和糖皮质激素受体抑制剂(100nM RU486)共同处理,DEX和mTOR抑制剂(25μM Rapamycin)共同处理,处理3h后发现,糖皮质激素处理显著的激活了AMPKα Thr172、mTOR Ser2448位点的磷酸化水平;糖皮质激素和RU486共同处理显著地抑制了mTOR Ser2448位点的磷酸化水平,显著的激活了p70S6K Thr389位点的磷酸化水平,糖皮质激素和Rapamycin共同处理显著的抑制了mTOR Ser2448位点的磷酸化水平,显著的激活了p70S6K Thr389位点的磷酸化水平。试验四、五结果表明,糖皮质激素通过糖皮质激素受体作用于调控蛋白质合成的通路,AMPK及mTOR信号通路可能参与了糖皮质激素对蛋白质合成的调控过程,可能依赖于Akt,另外,糖皮质激素一方面可能通过mTOR来影响p70S6K,另一方面也可能不通过mTOR,而通过其它路径来影响p70S6K。试验六培养鸡成肌细胞,分为对照组,DEX(1μM)组,支链氨基酸组(10mM BCAA leu:Ile:Val=2:1:1.2),DEX和支链氨基酸共同处理组,分别处理0.5h,1h,3h,12h,试验发现糖皮质激素和BCAA对蛋白质合成通路的影响可能存在时间效应,在处理3h时,糖皮质激素处理显著降低了S6K1的mRNA表达水平,AMPKα2的mRNA表达水平有下降趋势;在处理1h时,BCAA处理对AMPKα2、mTOR、4E-BP1和S6K1的mRNA表达有显著的抑制作用,结果表明DEX和BCAA可能都通过影响AMPK信号通路和mTOR信号通路来实现对肌细胞蛋白质合成的调控。
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