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骨保护素(oeteoprotegerin, OPG)是一种能阻断RANKL与RANK结合,抑制破骨前体细胞分化、成熟破骨细胞活性并诱导其凋亡的分泌型糖蛋白。体内调节骨代谢的许多激素和细胞因子最终通过调节OPG/RANKL的表达而发挥作用。鉴于OPG在骨代谢中的重要调节作用,本文旨在构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-chOPG;体外试验,通过脂质体介导转染鸡胚成纤维细胞,表达能够抑制破骨细胞生物学活性的外源chOPG蛋白；体内试验,通过肌肉注射蛋鸡骨骼肌,探讨质粒pcDNA3.1(+)-chOPG在蛋鸡体内的分布、外源chOPG蛋白的表达和对主要器官组织的病理学变化,以及对蛋鸡生化指标、生产性能和骨骼代谢的影响,为进一步研究笼养蛋鸡骨质疏松发生机制提供新的思路。试验Ⅰ鸡骨保护素(chOPG)的亚克隆及pcDNA3.1(+)-chOPG真核重组质粒的构建亚克隆OPG基因开放阅读框并构建pcDNA3.1(+)-chOPG真核重组质粒。以本实验室保存的重组鸡pMD1 8-T-OPG质粒为模板,用PCR方法亚克隆OPG基因的阅读框(ORF),并插入NheⅠ、XhoⅠ酶切位点和相应的保护碱基,连接到克隆载体pMD18-T,测序、双酶切后,用T4DNA连接酶连接到pcDNA3.1(+),连接产物转化大肠杆菌DH5α进行筛选、序列测定。得到了OPG基因的阅读框(ORF)的双链DNA,阳性质粒酶切鉴定有pcDNA3.1(+)和chOPG两条带；OPG基因的阅读框(ORF)测序图谱与GenBank上登录的鸡OPG (DQ098013)(?)报道完全一致。成功构建真核重组质粒pcDNA3.1(+)-chOPG.试验Ⅱ质粒pcDNA3.1(+)-chOPG体外转染成纤维细胞表达的研究探讨质粒pcDNA3.1(+)-chOPG体外转染鸡胚成纤维细胞chOPG蛋白表达。由阳离子脂质体2000介导将pcDNA3.1(+)-chOPG质粒转染鸡胚成纤维细胞,用RT-PCR法检测OPG mRNA的转录；间接免疫荧光试验检测细胞内蛋白表达；Western Blot检测表达的chOPG蛋白的大小；ELISA法检测上清液中OPG蛋白含量。在pcDNA3.1(+)-chOPG质粒转染组OPG mRNA转录结果呈阳性,而对照组和空载体组呈阴性;在荧光显微镜下观察,质粒组有绿色荧光成纤维细胞出现,而对照组和空载体组呈阴性,并且脂质体和质粒的比例为1：3时,效果最明显。Western Blot检测表达的chOPG蛋白的大小约为90 kDa；ELISA检测显示chOPG含量在上清液中为15.78±0.22 ng·mL-1。pcDNA3.1(+)-chOPG质粒能被转染到鸡胚成纤维细胞中,并表达chOPG蛋白。试验ⅢchOPG重组蛋白对体外培养鸡胚破骨细胞凋亡、骨吸收功能的影响研究真核重组质粒pcDNA3.1(+)-chOPG转染鸡胚成纤维细胞后表达的外源chOPG蛋白对破骨细胞凋亡、骨吸收功能的影响。机械分离鸡胚破骨细胞,获得破骨细胞悬液,随机分为空白对照组、空载体组、pcDNA3.1(+)-chOPG质粒组。用流式细胞仪检测破骨细胞凋亡结果；重氮盐法检测破骨细胞分泌的TRAP活力;噬骨试验检测骨吸收陷窝的数量和面积以及测定钙离子含量,观察破骨细胞的骨吸收功能。与空白组和空载体组相比,pcDNA3.1(+)-chOPG质粒组破骨细胞凋亡率显著升高,而TRAP酶浓度,骨吸收陷窝的数量、面积和钙离子浓度,pcDNA3.1(+)-chOPG质粒组下降,差异极显著(P<0.01)。真核重组质粒pcDNA3.1(+)-chOPG转染鸡胚成纤维细胞后表达的OPG蛋白能抑制体外破骨细胞的生物学活性,促进破骨细胞凋亡。试验ⅣchOPG外源蛋白的表达及其在不同组织中的分布研究chOPG外源蛋白的表达及其在不同组织的分布。36羽56周龄的ISA蛋鸡随机分为2组(12羽对照,24羽试验)。对照组和试验组分别肌肉注射300pL生理盐水和300雌质粒pcDNA3.1(+)-chOPG。注射后3h、1 d、7d、14d、21d、28d采集注射部位的肌肉、对侧肌肉、肝、肾、脾及心脏。分别采用RT-PCR和Western Blot (?)(?)方法检测其组织中chOPG基因蛋白表达及含量,PCR法和组织切片技术用于检测质粒分布和组织病变。注射部位骨骼肌3h后即检测到chOPG蛋白的表达,7d达到最高值,然后逐渐下降,28d完全消失。1d后所有组织均检测到质粒pcDNA3.1(+)-chOPG,以后则逐渐下降,28 d后所有组织中均消失。质粒在肝脏中代谢速度最快。主要器官即心、肝、脾、肾、注射部位骨骼肌组织未发现明显的病理学变化。肌注300μg pcDNA3.1(+)-chOPG质粒后,chOPG外源蛋白及质粒表达量在开始数天较高,以后逐渐下降,28 d完全消失,主要器官组织未发现明显的病理学异常。试验Ⅴ质粒pcDNA3.1(+)-chOPG对产蛋后期ISA蛋鸡生产性能和骨代谢的影响探讨质粒pcDNA3.1(+)-chOPG对产蛋后期ISA蛋鸡生产性能和骨代谢的影响。80羽56周龄ISA蛋鸡随机分为A、B、C、D 4组。每隔2周肌肉注射剂量分别为0μg、200μg、400μg、600μg pcDNA3.1(+)-chOPG真核重组质粒。每周采血测血钙、血磷、碱性磷酸酶。每天记录产蛋量、破壳蛋数,测定蛋壳强度和厚度。最后测定骨生物力学特性和骨密度。各试验组血浆中钙、磷含量的总平均值均低于对照组,呈下降趋势,与对照组相比,血钙有显著性差异(P<0.05),而血磷含量差异不显著(P>0.05)；B、C、D组与A组相比,血浆碱性磷酸酶活性的总均值呈上升趋势,有显著性差异(P<0.05)。产蛋后期蛋鸡周平均产蛋量、蛋壳厚度和强度与对照组比较,均无显著性差异(P>0.05)。B组平均软破壳蛋数量与A组相比,无显著性差异,而C、D组平均软破壳蛋数量上升,有显著性差异(P<0.05)。各试验组胫骨和股骨的最大载荷值、韧性和骨密度均呈上升趋势,与A组相比均有显著性差异(P<0.05)；其中B组有极显著性差异(P<0.01)。结果表明,适当剂量(200μg)的外源质粒pcDNA3.1(+)-chOPG在不影响产蛋量的情况下,可以改善骨代谢。