肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)已经成为全球第五大常见恶性肿瘤，其死亡率在所有恶性肿瘤中居第三位。研究发现HCC对传统抗癌疗法，如放疗和化疗具有高度耐受，因此，有关HCC的治疗新策略和有效预防方案仍迫切需要。G蛋白偶联受体激酶(G protein-coupled receptor kinases, GRKs)属于丝/苏氨酸激酶家族，是人体内一类重要的激酶，参与调节细胞内多种信号通路。研究表明，GRKs通过调节一些G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors, GPCRs)和非GPCR信号通路参与多种恶性肿瘤的发生发展。然而， GRKs在HCC侵袭转移中的作用及其可能的作用机制尚不清楚。前列腺素受体EP2属于GPCRs，已有文献报道，EP2受体介导多种肿瘤的血管生成、侵袭和转移。本课题组前期研究发现，EP2受体选择性激动剂Butaprost，能够明显刺激HCC细胞的增殖和迁移。本实验在以往研究基础上，首先收集临床标本，分析比较GRK2和GRK3在HCC患者肝脏肿瘤组织、非瘤组织及不同分化程度肝癌组织之间的表达差异；整体动物实验部分，采用腹腔注射二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine，DEN)诱导C57BL/6J小鼠的肝癌模型，检测了不同造模时间小鼠肝脏GRK2、GRK3和EP2的表达变化；体外实验选取转移潜能不同的人HCC细胞株，从细胞和分子水平探讨GRK2和GRK3在不同转移潜能人HCC细胞株中的表达差异及EP2的分布变化，并采用针对GRK2的小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)干扰HCC细胞株中GRK2基因表达，进一步探讨GRK2在HCC侵袭和转移中的作用及相关机制。目的：收集临床HCC患者肝脏标本，并建立DEN诱导的小鼠肝癌模型，观察分析肝脏GRK2和GRK3的表达情况；体外选取不同转移潜能HCC细胞株检测GRK2、GRK3和EP2的表达，并应用GRK2siRNA转染HCC细胞株，明确GRK2在HCC侵袭和转移中的作用及相关机制。方法：选取行肝癌切除术的72例HCC患者的肝癌组织石蜡标本，及17例肝内胆管结石患者的石蜡标本作为正常对照，通过免疫组化方法检测了不同分化程度肝癌组织中GRK2和GRK3的表达变化；同时收集临床18例HCC患者术中新鲜肝脏组织标本，qPCR和Western blot法检测肝组织中GRK2和GRK3表达水平的变化。于出生14天的C57BL/6J小鼠腹腔注射DEN建立肝癌模型，根据造模的时间，设正常对照组（0w）和模型组（8、16、24、32、40w），并以Western blot法检测肝脏中GRK2和GRK3表达水平的变化，免疫组化法检测EP2的表达情况。体外选用转移潜能由低到高的人HCC细胞株(HepG2、SMMC-7721、MHCC97L、MHCC97H和HCCLM3)和永生型人肝细胞株L02，采用Westernblot法和激光扫描共聚焦显微镜技术检测GRK2、GRK3和EP2表达分布情况；进一步运用针对GRK2siRNA转染HCC细胞株，设置空白对照组和阴性对照组，qPCR和Western blot法检测转染后GRK2表达的变化，并以细胞划痕法和Transwell法检测转染后细胞的移行能力和侵袭能力变化；同时，Western blot法检测干扰后HCC细胞中ERK1/2、p-ERK1/2、Akt和p-Akt表达水平的变化。结果：1. GRK2和GRK3在HCC患者肝脏中的表达变化免疫组织化学染色法检测HCC患者肝癌组织和肝内胆管结石患者肝脏组织标本，结果显示，GRK2在肝内胆管结石患者肝脏组织中的表达明显高于HCC患者肝脏组织，低分化HCC患者的肝癌组织中GRK2的表达水平几乎成阴性，明显低于高分化HCC患者；而GRK3在不同分化程度HCC患者肝脏组织中的表达无明显差异。qPCR和Western-blot结果显示，HCC患者肿瘤组织中GRK2的表达明显低于非瘤组织，而GRK3的表达在肿瘤组织和非瘤组织中差异并不明显。2. GRK2和GRK3在DEN诱导的肝癌模型小鼠肝脏中的表达情况Western blot检测结果显示，在DEN诱导的小鼠肝癌模型中，随着造模时间的延长，GRK2的表达水平逐渐降低，GRK3的表达无明显差异。同时，免疫组化结果发现，肝癌模型小鼠肝脏EP2的表达明显强于正常小鼠。3. GRK2、GRK3和EP2在不同转移潜能HCC细胞株中的分布和表达情况Western blot检测结果显示GRK2在正常肝细胞中表达较高，在HCC细胞中随着转移潜能的增加，其表达逐渐降低，而GRK3的表达在不同细胞系中没有明显差异。激光扫描共聚焦显微镜观察发现，GRK2、EP2主要分布在胞浆和胞膜，且GRK2在正常肝细胞中的荧光强度要强于HCC细胞；选择性的EP2受体激动剂Butaprost刺激HCC细胞株后，细胞膜上EP2荧光明显增强。超速离心法分离胞浆和胞膜蛋白，Western blot检测结果显示，Butaprost刺激30min后，与转移潜能较低的HepG2细胞相比，转移潜能较高的HCCLM3细胞膜上EP2表达较强，而GRK2表达较弱。4.转染针对GRK2siRNA对人SMMC-7721细胞迁移和侵袭能力的影响GRK2在不同转移潜能HCC细胞系中的表达差异提示其可能与转移相关。在SMMC-7721细胞转染GRK2siRNA后，GRK2的mRNA和蛋白表达均比对照组明显降低。细胞划痕实验结果显示，转染后SMMC-7721细胞的24h划痕愈合面积与对照组相比显著增加；同时Transwell统计结果发现，转染后SMMC-7721细胞的穿膜个数与对照组相比明显增多，侵袭能力明显增强。5.转染针对GRK2siRNA对人SMMC-7721细胞ERK1/2、p-ERK1/2、Akt和p-Akt信号分子的影响Western-blot检测结果发现，转染GRK2siRNA后，SMMC-7721细胞中p-ERK1/2水平没有明显的变化，而p-Akt水平明显增高，提示低表达GRK2可能促进EP2受体信号下游的Akt通路的激活。结论：1.在不同分化程度的HCC患者肝脏组织标本中，GRK3的表达没有明显变化，而低分化HCC患者肝脏组织中GRK2的表达明显低于高分化HCC患者组织。在DEN诱导的肝癌模型小鼠肝脏组织中，GRK2的表达随造模时间的延长而逐步减少，GRK3的表达则没有明显变化。这些结果提示GRK2可能是抑制HCC发展的重要分子。2.体外实验结果发现，在不同转移潜能的人HCC细胞株中，GRK2的表达随着转移潜能逐渐升高而逐渐降低，GRK3则没有明显变化，提示低表达GRK2可能与HCC细胞的侵袭转移有关。选择性的EP2受体激动剂Butaprost刺激HCC细胞株后，高转移潜能细胞株细胞膜上的GRK2表达低，而EP2膜表达增加。这些结果提示可能由于GRK2对EP2受体信号下调能力的减弱，致HCC细胞的侵袭和转移增强。3.转染GRK2siRNA后，SMMC-7721细胞内GRK2的表达显著降低，同时细胞迁移能力和侵袭能力明显增强；且转染后细胞内pAkt表达水平明显升高，而p-ERK1/2水平并无明显变化，提示GRK2可能通过抑制EP2受体下游Akt信号的激活来抑制HCC的侵袭和转移。