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目的:肺癌是胸部最常见的恶性肿瘤之一,也是世界上最致命的恶性肿瘤。肺癌患者早期症状并不明显,约有四分之三的患者在发现时已为晚期,且多为非小细胞肺癌(NSCLC),传统的手术、放疗、化疗等方式治疗效果均不理想,新兴的生物治疗如络氨酸激酶抑制剂、免疫检测点抑制剂等,虽然在临床上逐渐广泛应用,但肺癌患者的五年生存率并没有较大的改善。本实验将NKG2D与靶向嵌合抗原受体修饰的T细胞(Chimeric Antigen Receptor T Cell)相结合,通过电穿孔转染方式,将携带NKG2D-CAR的非病毒微环DNA载体质粒转入T细胞内,制备成靶向NKG2D配体的三代NKG2D-CAR-T效应细胞,并对其转染效率、细胞因子分泌功能及杀伤效率进行研究。方法:通过电穿孔的方法将含有NKG2D目的片段的微环DNA质粒转染到T淋巴细胞内,制备成NKG2D-CAR-T细胞。倒置显微镜下观察电穿孔转染T细胞的效果及转染效率,细胞活率检测电穿孔对T细胞存活率的影响,流式检测电穿孔方法转染微环DNA对T细胞表型的影响,流式分析及Western blot分别检测NKG2D-CAR在T细胞表面的表达及蛋白表达情况。NKG2D-CAR-T细胞分别与细胞表面低表达NKG2D配体的HCC827细胞株及天然高表达NKG2D配体的PC-9细胞株体外共培养,CCK8法检测CAR-T细胞的体外选择性杀伤活性,ELISA法检测细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌量。结果:1.通过电穿孔的方法,成功构建第三代NKG2D-CAR-T细胞,流式及Western blot均检测到T细胞中NKG2D-CAR蛋白的表达。2.电转染的方法以及微环DNA载体对T细胞的表面分子表型没有影响。3.NKG2D-CAR-T细胞对高表达NKG2D配体的非小细胞肺癌细胞PC-9抑制率高于低表达NKG2D配体的非小细胞肺癌细胞HCC827。4.NKG2D配体高表达的非小细胞肺癌细胞PC-9与低表达NKG2D配体的非小细胞肺癌细胞HCC827相比,更能促进NKG2D-CAR-T细胞分泌IL-2?IFNγ。结论:1.通过电穿孔可以成功将微环DNA质粒转染至T淋巴细胞,制备成NKG2D-CAR-T细胞并表达NKG2D-CAR蛋白。2.NKG2D-CAR-T细胞在体外对表达NKG2D配体的非小细胞肺癌细胞具有抑制其生长作用,并可大量分泌IL-2及IFNγ。