背景目的及意义:　　顺铂是常用的肿瘤化疗物质，顺铂与DNA结合形成链内和/或链间链加合物造成遗传物质的损伤，诱发一系列信号蛋白的改变，启动复杂的诱导细胞死亡的机制:如p53活化、p38 MAPKs和/或JNKs活化，NFκ B抑制等。白杨素(chrysin)是在中草药、蜂蜜及蜂胶中含量丰富的一种黄酮类物质，具有多种生物学功效如抗炎、抗氧化等，近年已有学者在动物试验和体外研究中观察到白杨素及其衍生物具有一定的肿瘤预防、抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡的潜能。在此，我们研究证明了白杨素与顺铂联合应用能够有效促进肿瘤细胞死亡，并呈剂量效应关系和时间效应关系(Fig.1)。白杨素联合顺铂促进的肿瘤细胞死亡是caspase依赖的细胞凋亡(Fig.2)。这一研究结果在细胞和分子水平为白杨素联合顺铂的应用价值提供了强有力的支持，更为进一步的分子机制探索提供了平台和线索。　　在体外培养肿瘤细胞中白杨素联合顺铂能够有效促进肿瘤细胞凋亡。白杨素可以已通过ERK1/2活化促进的p53磷酸化稳定p53不被降解，发挥p53诱导肿瘤细胞凋亡的肿瘤抑制蛋白作用，提高顺铂对肿瘤细胞的细胞毒性。尽管距离白杨素真正应用到肿瘤临床治疗中还需要对其抗肿瘤的作用及机制做更多更深入的研究，但本研究的发现为白杨素在肿瘤治疗中的应用又提供了一个新的证据。为顺铂联合用药研究探索了一个可行性更好的方案。　　目标:　　1、在细胞、分子多水平、多层面探明白杨素联合顺铂对肿瘤细胞凋亡的促进作用。　　2、体外初步探索白杨素联合顺铂对肿瘤细胞凋亡促进作用的分子机制，分析白杨素对p53蛋白及其相关信号通路的影响，探索p53蛋白在白杨素联合顺铂协同诱导肿瘤凋亡作用中的调控机制。　　3、为白杨素联合顺铂的抗肿瘤作用研究的体内研究提供良好的联合用药方案和理论基础，为体内分子机制研究提供线索。　　4、为黄酮类等天然资源在肿瘤治疗中的应用提供新的思路，为解决顺铂耐药性和化疗的低敏感性问题提供可行性更强的治疗方案。　　方法:　　1、敏感细胞株的选择:　　选择多种组织来源的人类肿瘤细胞系:肝肿瘤细胞(Hep G2、Hep3B)、结直肠癌细胞(HCT-116)、鼻咽癌细胞(CNE1)等多种细胞，不同剂量白杨素(5、10、20、40μM)预处理细胞2h后再联合不同剂量的顺铂(2、5、10μ g/mL)，倒置显微镜下观察细胞的形态和存活状态，确定单独顺铂或白杨素不出现细胞死亡而联合两种物质则出现明显细胞死亡增加的细胞为对联合作用敏感的肿瘤细胞。　　2、细胞死亡和凋亡的定量检测分析:　　倒置显微镜下观察细胞形态和密度，拍照记录细胞死亡的定量资料;流式细胞术检测亚二倍体峰获得亚二倍体峰在整个细胞周期中的百分比，作为细胞死亡的定量指标;荧光核燃料Hoechst33342或DAPI.染色识别凋亡特异的核固缩确定凋亡细胞，计数200个细胞中凋亡细胞数，获得凋亡细胞定量指标。　　3、研究白杨素联合顺铂促进肿瘤细胞凋亡的可能机制:　　以Westem blot免疫印记分析磷酸化和总的p53蛋白在不同时间点的变化情况，并以免疫荧光方法分析磷酸化的p53进入细胞核的量进行分析，明确转录因子p53在白杨素联合顺铂促进肿瘤细胞凋亡中的作用。　　4、证明白杨素联合顺铂促进肿瘤细胞凋亡效应中p53作为转录因子的作用:　　以Westem blot免疫印记分析p53调控的前凋亡蛋白Bax、DR5及p53相关的凋亡抑制蛋白Bcl-2的变化，外源及内源凋亡途径的启动蛋白caspase-8和caspase-9的活化改变情况，及利用线粒体细胞质分离试剂盒获得的细胞质中细胞色素c量的改变，证明p53在白杨素联合顺铂促进肿瘤细胞凋亡效应中转录因子角色。　　5、白杨素联合顺铂促进肿瘤细胞凋亡效应中影响p53转录活性的上游分子事件:　　按PureLink RNA Mini Kit(Ambion)试剂说明数提取HepG2细胞总RNA。OneStep RT-PCR分析p53的表达情况，Western blot免疫印记分析磷酸化和总MDM2和ERK1/2的时间变化规律，探索影响p53转录活性的上游分子变化，并使用ERK1/2抑制剂U0126来证明ERK1/2的活化对p53磷酸化的影响。对白杨素联合顺铂促进肿瘤细胞凋亡的分子机制做深入探讨。　　6、统计分析:　　数据采用SPSS13.统计软件分析处理，实验数据用均数±标准差（mean±SD）表示。两组之间样本均数比较以t检验进行统计学分析，包括两独立样本t检验和单样本t检验。多组间均数比较满足方差齐性以单因素方差分析(one-wayANOVA)进行比较，组间两两比较采用LSDs法;若方差不齐，采用welch检验，组间两两比较采用Dunnetts T3法进一步进行统计学分析，p＜0.05为有统计学意义。　　结果:　　1、白杨素和顺铂联合应用能够有效地促进多种人类肿瘤细胞死亡:顺铂处理三种人类肿瘤细胞株:顺铂分别以不同浓度对肝肿瘤细胞(Hep G2)5μ g/mL、结直肠癌细胞(HCT-116)10μ g/mL、鼻咽癌细胞(CNE1)10μ g/mL处理24 h，倒置显微镜下的形态学观察均未发现明显的细胞死亡，说明顺铂在此剂量下对三种肿瘤细胞均为观察到细胞毒性作用。同样的单独白杨素(Hep G240 M，HCT-11640μ M，CNE120μ M)处理三种人类肿瘤细胞株也未观察到细胞死亡。然而三种人类肿瘤细胞在白杨素预处理2h后以顺铂联合处理24 h均可以在倒置显微镜下观察到肿瘤细胞是大量死亡。这也提示白杨素联合顺铂对肿瘤细胞死亡的促进作用具有一定的广谱性。进一步的流式细胞术分析亚二倍体峰，在Hep G2细胞定量分析结果显示:白杨素联合顺铂对肿瘤细胞死亡的促进作用具有剂量效应和时间效应关系。　　2、白杨素联合顺铂促进的肿瘤细胞死亡是半胱氨酸天冬氨酸酶(caspase)依赖的细胞凋亡:　　为明确白杨素联合顺铂促进的肿瘤细胞死亡是细胞凋亡，我们首先用细胞核特异性荧光燃料DAPI染色识别凋亡标志性核固缩。白杨素预处理Hep G2细胞后与顺铂联合处理24 h，可以观察到含有核固缩的凋亡细胞量显著增加(F=18.050，P=0.007)，这为细胞凋亡提供了形态学证据。为进一步证实以上结论Western blot试验检测细胞凋亡的两个标志性蛋白PARP(Poly(ADP-ribose)poly-merase cleavage)和半胱氨酸天冬氨酸酶(Caspase)，结果显示PARP和Caspase-3的前蛋白减少、活化裂解片段出现，而且总Caspase的抑制剂Z-VAD-fmk，能够有效的抑制白杨素和顺铂联合作用引起的细胞死亡(F=85.883，P＜0.001)及逆转标志性凋亡蛋白（PARP和Caspase-3）的改变。　　3、p53在白杨素联合顺铂诱导的肿瘤凋亡作用中发挥重要的作用:　　因为p53在顺铂诱导的肿瘤细胞凋亡中的重要作用，所以我们比较了白杨素联合顺铂分别处理p53野生型肝肿瘤细胞(Hep G2)和p53缺失肝肿瘤细胞(Hep3B)诱导凋亡的差异:白杨索联合顺铂处理肿瘤细胞24 h后，细胞核特异性荧光燃料Hoechst33342染色，观察到Hep G2细胞凋亡量显著增加（t=-8.110，P=0.001）说而Hep3B未见细胞死亡的显著增加（t=-1.512，P=0.205）。随后的p53蛋白分析可观察到白杨素处理Hep G2细胞6h时p53蛋白水平就开始增加，而此时间点单独顺铂处理的Hep G2细胞中并未观察到p53蛋白水平的改变。更为重要的是白杨素联合顺铂处理对p53蛋白水平影响很显著，尤其是在12 h时间点（F=17.822，P=0.003），这提示p53蛋白在白杨素联合顺铂促进肿瘤细胞凋亡中发挥了作用。15位点丝氨酸磷酸化的p53蛋白水平也显著增加(F=105.565，P＜0.001)与总p53蛋白水平的变化一致，且p-p53/p53值也显著提高(F=39.068，P＜0.001)。这个结果可以在免疫荧光的结果中得到证实，15位点丝氨酸磷酸化的p53蛋白入核显著增加（F=38.164，P＜0.001）。　　4、白杨素通过影响p53下游的分子事件促进顺铂诱导肿瘤细胞凋亡。　　5、白杨素通过活化ERK促进p53在15位点的丝氨酸磷酸化使p53活化入核发挥作用。　　结论:　　1、白杨素联合顺铂可以有效促进人类肿瘤细胞凋亡。　　2、白杨素预处理引起的p53蛋白活性增高是白杨素联合顺铂促进肿瘤细胞凋亡的内在机制。　　3、在白杨素和顺铂联合诱导肿瘤细胞凋亡的促进效应中，白杨素预处理活化了ERK1/2进而磷酸化p53促进p53调节的下游Bax和DR5高表达、Bcl-2低表达，最后启动内源和外源凋亡途径，促进肿瘤细胞凋亡增加。