典型的BMPs信号转导途径是：BMPs作用于靶细胞上特异性跨膜丝苏氨酸激酶受体，使Ⅰ型受体和Ⅱ型受体形成异聚体复合物，Ⅱ型受体使Ⅰ型受体蛋白磷酸化，磷酸化的Ⅰ型受体进一步磷酸化受体调节型Smad(R-Smad)，并将信号传递到Smad途径。R-Smad从跨膜受体上脱离进入细胞浆，与共同型Smad(C-Smad)结合后，进入细胞核。在核内其他DNA结合蛋白的参与下，Smad异聚体复合物作用于特异的靶基因，起转录调节作用。PKA和PKC是普遍存在于动物细胞内的两种蛋白激酶，调节着细胞的物质代谢、基因表达调控、细胞增殖、分化等生物学行为。本文研究了PKA和PKC在SD大鼠成骨细胞中的表达和活性变化，及其在BMP影响大鼠成骨细胞的生物学行为过程中的交互作用。实验进行了以下三个方面： 一、SD大鼠成骨细胞体外培养及生物学特性。按照文献报道的差速贴壁纯化的方法，并且在原代培养过程中就使用含有地塞米松、β-磷酸甘油钠、抗坏血酸的诱导培养液，体外原代培养SD大鼠成骨细胞，观察其生物学行为、成骨表型及DMSO对细胞的影响，旨在为以后的实验做好细胞培养方面的准备。试验中观察到：7-10天达到80％汇合状态。细胞饱满，呈梭形、多角形、星形，胞核清晰，核浆分界明显，有一至两个核仁，折光性强，有细长的突起，并且有的突起相互连接在一起。细胞倍增时间(Td)为90.6小时，18小时贴壁率达90％。在传代细胞的生长密集区中央可见到茜素红染色阳性的钙结节。用ALP钙钴法和免疫细胞化学染色，见到几乎所有的细胞胞浆中均出现ALP染色阳性的棕黑色颗粒和Ⅰ型胶原阳性的棕黄色颗粒。2％(V/V)浓度以上的DMSO组细胞形态不再均一，胞体欠饱满，胞浆内可见数量不等的颗粒状物。细胞活力降低，细胞内总蛋白量和ALP活性低于正常对照组。1％(V/V)DMSO短期内对成骨细胞的毒性作用并不大，与对照组没有差异。因此，在后续的实验研究中，一直采用原代即诱导培养、差速贴壁法传代的 第回军区大学协士学位论文细胞培养模式；在需要用到DMSO助溶时，将其实际工作浓度尽量降低。 二、PKA在SD大鼠成骨细胞分化成骨过程中的作用： l、PKA对SD大鼠成骨细胞增殖和分化的影响：成骨细胞培养驯化后，分组以 cAMP（lmM）、PKI（ling／L）、hBMP－2（200ug／L）、PKIrhBMPZ （PKI预刺激1小时后加山BM卜2）干预，MTT法观察细胞增殖情况，检测细胞内ALP活性，判断细胞分化成骨能力。将培养细胞接种于35mm培养皿，门第二天始，以。＊＊P、＊以分别每天作用1小时。·周后，西素红染色法钙g，’iV计数测定成骨细胞矿化能力。结果显示，SD大且成骨细胞的增师状况变可 不大（p＞005），。＊＊P干预60分钟后＊u 活性升高（p＜0＊5），Pm干灿的结果＊相反，＊＊ 活性下降（p＜0刀5）。在PK互SM卜2组，山8＊＊2作则］时问延长（6O分钟）后，＊＊P活性有所升高。钙结节计数经＊NOVA检验，gu问存在显著差异，cAMP组形成的钙结节增多，PKI组钙结节数量明显降低 （P＜0．of ）。 2、大鼠成骨细胞中PKA的表达：将成骨细胞传代制备细胞爬片。驯化培养24 ’h时后，分组以CAMP、PKI、hBMP．2分别作用30分钟，吸养培养液，PBS漂洗 2次，95％乙醇固定 15分纠J后，按 SABC试剂盒说明进V CPKA、从CPKA。免疫组化染色，并对各组染色结果进行图象分析。结果显示，各组均观察到cPKA。及cPKA。的阳性染色，细胞浆内可见枯黄色颗粒。PKI组在丛卅村，cAMP刺激组最强。 3、rhBMI。2对大鼠成骨细胞 PKA活性的影，旧：经驯化培养的大鼠成骨纠】胞，分组以山SM卜2、＊K卜山8＊卜二（＊m预刺激30分钟后加山SM卜2）分别作用mJO石0分钟后，℃P掺入底物法检测PKA活性结果显示，fhBM卜2干预细胞30、60分钟后PKA活性升高，PKI预刺激30分钟后，细胞PKA活性降低（P＜0刀5）。在PKI预刺激组，hBMP－2又可以使己经降低的PKA活性逐渐升高（Prto．05）。 4、大鼠成骨细胞中BMP一PKA的利关机制初探：培养细胞驯化24小时 ．3－ 第四军医大学博士学位论文后，以 200ng／ml rhBMP上分别作用 10、20、30分钟，行 cAMP放射免疫检测。thBMPZ分别作用 30、60分钟后，行 PKA mRNA RTPCR试验。结果显示，CAMP浓度与对照组无明显差异中 力5人thBMPZ对成骨细胞 PKAnRNA的影响很小，在作用60分钟之内，没有显著影响（p＞0刀5人 ，（、P＊C在SD大鼠成骨细胞分化成骨过程中的作用： l、PKC对SD大鼠成骨细胞增殖和分化的影n响：成骨细胞培养驯化后，分组以PMA（10mM）、PC（100uM）、hBMP－2（200t唱几）、PC－rhBMPZ（PC预刺激30 分钟后加rhBMP－2）干预，MTT法观察细胞增值情况，检测细胞内ALP活性，判断细胞分化成骨能力。将培养细胞接种于35mm培养皿，以CAMP、PKI分别每天作用1’J’时。一周后，菌素红染色法钙结节计数测定成骨细胞矿化能力。结果显示，BMP和 PMA组在 24小时内对成骨细胞?