肌生成抑制素(Myostatin, MSTN)是骨骼肌生长的负调控因子,抑制其功能在畜牧业和临床医学上具有重要意义,其功能调控是否成功的关键在于明确肌生成抑制素相互作用蛋白的作用机理。目前,本研究室利用基因克隆技术、免疫组化技术.cDNA文库构建等技术对MSTN基因的组织结构、染色体定位、表达分析及MSTN与受体结合后的信号转导过程等方面已开展了较深入的研究,国际上对MSTN的研究主要集中在肌肉细胞内有哪些蛋白质与MSTN发生相互作用,及相互作用蛋白的功能和作用机理。酵母双杂交技术是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间相互作用关系的技术,可以高效广谱的筛选细胞内相互作用蛋白,是目前筛选相互作用蛋白的一种强有力的先进手段。本研究利用酵母双杂交系统从牛肌肉cDNA文库中筛选与MSTN相互作用蛋白,并利用GST pull-down技术与免疫共沉淀技术在体内和体外对筛选出的蛋白质进行科学验证,研究结果不仅为阐明牛肌生成抑制素的调控机制提供科学参考,而且也为牛肌生成抑制素的功能调控研究奠定基础。本研究结果主要有以下两个方面：第一方面,酵母双杂交系统筛选牛MSTN结合蛋白研究。利用分子克隆技术构建诱饵质粒,将构建好的诱饵质粒pGBKT7-MSTN转化到Y2HGold酵母菌中,随后,与构建好的含有牛肌肉cDNA文库的Y187酵母杂交配对,菌液涂布接种在SD/-Trp-Leu-His-Ade营养缺陷型培养基上,筛选出与MSTN相互作用的蛋白,并对阳性克隆进行分析和鉴定。经严格筛选,结果得到一种与MSTN特异相互作用的T-cap蛋白。第二方面,T-cap蛋白与MSTN相互作用的体内、外验证研究。1、体内验证研究：利用免疫共沉淀技术即构建带GFP标签的MSTN融合蛋白重组载体pLEGFP-MSTN和带FLag标签的融合蛋白重组载体pcDNA3.0-FLag-T-cap,共同转染293T细胞,裂解细胞后,用抗FLag单克隆抗体沉淀FLag-T-cap蛋白复合物,用抗GFP单克隆抗体进行Western blot检测GFP-MSTN的表达,再利用反向免疫共沉淀进一步证明了MSTN与T-cap发生作用。2、体外验证研究：利用GST pull-down技术即通过构建GST-MSTN融合蛋白和pcDNA3.0-FLag-T-cap重组载体,将pcDNA3.0-FLag-T-cap重组载体转染293T细胞进行真核表达,将表达产物进行GST沉淀实验。研究结果表明MSTN蛋白与T-cap蛋白在体外发生结合作用。本研究在分子水平上开展了MSTN相互作用蛋白筛选和验证研究,为进一步研究MSTN的功能和作用机制提供了新的思路。