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第一部分在瘢痕疙瘩中Cthrc1表达升高及YAP核内表达目的:瘢痕疙瘩虽然是一种良性肿瘤,但对患者的生活质量带来了极大的影响。胶原三螺旋重复蛋白-1(Collagen triple helix repeat-containing protein 1,Cthrc1)是一种新近发现的基因,首先在气球样变的动脉管壁成纤维细胞中发现。YAP(Yes associated protein,Yes相关蛋白)在伤口修复过程中可发挥促进成纤维细胞活化及基质合成的作用。为探讨Cthrc1和YAP在瘢痕疙瘩与正常皮肤中是否存在差异性,我们Cthrc1和YAP在瘢痕疙瘩组织和正常皮肤组织中及提取的两种成纤维细胞中的表达情况。方法:分别收集瘢痕疙瘩、正常皮肤的新鲜组织标本,采用荧光定量PCR、蛋白质印迹的方法检测Cthrc1、YAP组织水平的表达情况。复习临床及病理诊断为瘢痕疙瘩的HE染色切片,选出包含正常皮肤区、纤维增生区及均质化区的典型石蜡组织,通过免疫组织化学法检测Cthrc1、YAP在各区内的表达定位情况。使用胶原酶两步消化法从收集的新鲜瘢痕疙瘩、正常包皮组织中提取皮肤成纤维细胞,采用倒置显微镜观察细胞形态,并用细胞免疫化学法进行验证。Cthrc1、YAP在细胞中的表达水平采用荧光定量PCR、Western blot的方法进行检测。细胞免疫荧光法检测Cthrc1、YAP在两种成纤维细胞内的表达定位。结果:Cthrc1在瘢痕疙瘩组织中及瘢痕成纤维细胞中表达升高,且Cthrc1在瘢痕的纤维增生区升高最显著,主要表达于瘢痕成纤维细胞的胞浆内。与正常皮肤组织相比,YAP在瘢痕疙瘩中表达无明显差异,但在瘢痕原代成纤维细胞中YAP蛋白表达明显升高。免疫组化结果显示瘢痕疙瘩的纤维增生区及均质化区域的成纤维细胞的胞浆及胞核可表达YAP,在相对正常区域内成纤维细胞基本不表示YAP。在瘢痕成纤维细胞的胞浆及胞核内均有YAP的表达,然而,YAP仅表达在正常成纤维细胞的胞浆内。结论:在瘢痕疙瘩发展过程中,增加的Cthrc1和核内定位的YAP可能发挥重要的作用。第二部分Cthrc1在瘢痕疙瘩发展过程中通过抑制TGF-β通路和调节YAP核内表达发挥双向作用目的:瘢痕疙瘩被认为是皮肤伤口异常愈合及过度纤维化的病理过程。为验证升高的Cthrc1在瘢痕疙瘩形成中的作用及其相关作用机制,本部分研究着重关注于升高瘢痕及正常成纤维细胞的Cthrc1表达后,对胶原沉积的影响及是否涉及了TGF-β通路和YAP通路。方法:采用慢病毒感染的方法使正常成纤维细胞(NFs)和瘢痕成纤维细胞(KFs)的Cthrc1表达升高。采用CCK-8、Transwell的方法,检测NFs和KFs及Cthrc1的增高对两种成纤维细胞在细胞增生活性、迁移能力的影响。在分别过表达Cthrc1的正常成纤维细胞和瘢痕成纤维细胞中,实时定量PCR(RT-PCR)、Western blot分别检测Ⅰ型胶原、TGF-β通路蛋白和YAP表达情况,其次细胞免疫荧光的方法检测了YAP和p-Smad2/3定位表达是否受到升高的Cthrc1的影响。最后,TGF-β1刺激NFs和KFs观察Cthrc1的变化情况,探讨两者之间的关系。结果:瘢痕成纤维细胞的细胞增殖率及迁移率较正常成纤维细胞显著升高。当升高正常成纤维细胞Cthrc1的表达后,NFs的增殖率及迁移率也增高。而且Cthrc1的增加降低了正常成纤维细胞Ⅰ型胶原的表达同时促进了YAP的表达及向核内转移,此外,Cthrc1还抑制了NFs细胞的p-Smad2/3的核内转移。然而,当增加瘢痕成纤维细胞Cthrc1的表达后,瘢痕成纤维细胞的迁移率反而降低同时细胞增殖率无明显变化。与正常成纤维细胞相同的是增加Cthrc1可降低KFs的Ⅰ型胶原表达并抑制p-Smad2/3向核内转移。但不同的是Cthrc1降低了KFs的YAP表达并抑制了YAP的核转移。在正常及瘢痕两种成纤维细胞中,TGF-β1均可促进Cthrc1的表达。结论:Cthrc1可通过增加YAP的表达及促进YAP的核转位激活正常的成纤维细胞,同时通过降低YAP的表达和抑制YAP向核内转移使瘢痕成纤维细胞活性降低。此外,Cthrc1作为TGF-β通路的负反馈因子通过抑制p-Smad2/3核转移降低Ⅰ型胶原的合成。Cthrc1可能促进了正常的创伤修复,同时抑制了组织的过度修复。因此Cthrc1在瘢痕疙瘩形成过程中可能发挥着双向作用。