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研究背景溃疡性结肠炎(Ulcreative colitis,UC)是一种主要以结直肠粘膜及粘膜下层发生慢性、非特异性炎性病变,呈现出肠道粘膜充血、糜烂、溃疡、以及增生性改变的疾病[1]。由于UC的病因复杂及多种发病机制并存,因此临床疗效进展不明显,治愈难度大、常反复发作。UC的发病机制主要包括易感基因、肠道屏障、细胞周期(凋亡)、免疫及炎症等四大方面[9-10]。因此,针对UC的多种发病机制探求一种根源性的有效治疗方法,将对防治UC恶变提高患者生存质量有重要的意义。转录因子(Transcription factors,TFs)是一类在基因表达调控中发挥关键的正面或负面影响的核蛋白质。TFs通过转录调节基因表达几乎控制细胞分化和器官形成,细胞生长和凋亡,细胞信号转导。转录因子有核转录因子KB(Nuclear transcription factor kappa B,NF-κB)和活化细胞核因子(Nuclear factor of activated T cells,NFAT)。多项研究表明,NF-κB 和 NFAT 能参与到免疫反应、炎症反应、细胞凋亡和肿瘤发生等多种生物进程[23-26]。MicroRNAs(miRNAs)是一种大小约21-23个碱基的单链小分子RNA,能参与调控基因表达。近年来的研究显示,miRNAs在UC的发病的过程中发挥着重要的作用[28-32]。课题组在前期实验研究中发现了 miRNAs的一个新的非经典转录调节机制和功能——miR-939和miR-376a作为一种TFs(转录因子)内源性“圈套”,通过诱导转录因子NF-κB和NFAT,从而实现在转录水平上调节基因表达[8]。本研究旨在探究这种“圈套”策略在UC发生发展中的具体机制,并观察“圈套”策略对于UC模型小鼠的作用效果。本项目不仅可以补充UC发病机制的理论基础,更将为日后临床开展对UC的治疗提供新思路。目的1.通过对小鼠UC模型的miRNA芯片分析验证miR-939和miR-376a在UC中的差异表达并通过软件预测其靶基因。2.探究miRNA(-939、-376a)和TFs(NF-κB和NFAT)在UC病人组织中的表达情况,明确miR-939和miR-376A在UC发病中的作用。3.探究miR-939和miR-376a对NF-κB和NFAT的“圈套”策略在溃疡性结肠炎发病中的具体机制。4.验证“圈套”策略能够在UC模型小鼠中起到治疗作用。方法1.建立小鼠UC模型组和正常对照组,miRNA芯片分析找出差异表达的miRNA,确定miR-939和miR-376a为研究对象。TargetScan软件预测它们的靶基因。2.收集人溃疡性结肠炎UC临床样本,QPCR技术、原位杂交技术和免疫组化法分析UC组织样本中miR-939,miR-376a以及NF-κB,NFAT与正常样本之间的表达差异,分析其相关性。3.建立UC体外模型细胞,利用脂质体转染法构建miR-939组、miR-939抑制组、miR-376a 组、miR-376a 抑制组、人工 NF-κ B decoy ODN 组、人工 NFAT decoy ODN组及对照组。荧光素酶报告基因检测验证miRNAs对NF-κ B和NFAT的“圈套”作用,ELISA法检测相关炎症因子(IL-8,IL-1 β,IL-2、G-CSF、GM-CSF和MIP-2α)的表达水平,western-blot的方法检测免疫因子(TNF-α和TLR4)的表达水平,荧光显微镜观察紧密连接蛋白(claudins,occludins,和Z0-1)的分布情况,QPCR及western-blot法检测紧密连接蛋白的表达水平,western-blot法检测凋亡相关蛋白(cIAP,XIAP,Bax以及Caspase-3)的表达水平,流式细胞术检测细胞凋亡水平,并用荧光显微镜观察凋亡细胞的核的改变。4.建立小鼠UC模型,分为转染人工decoy(NF-κ B、NFAT)组、转染miRNA-decoy ODN(-939、-376a)组、UC模型组和正常对照组。HE染色观察各组小鼠结肠组织形态学改变,荧光素异硫氰酸酯法检测活体肠道通透性,免疫组化检测KF-κ B p65的表达,western-blot法检测凋亡相关蛋白表达,ELISA法检测相关炎症因子的表达,分析miRNAs“圈套”策略对UC小鼠的治疗作用。结果1.生物信息学分析发现,miR-939和miR-376a与TFs转录后水平的下游基因(Bcl-xL、FasL和TNF-a)均不存在结合位点。2.UC患者组织中的miR-939和miR-376a的表达显著低于正常人组织,NF-κ B和NFAT的表达显著高于正常人组织。原位杂交和免疫组化相关性分析提示miR-939与NF-κ B,miR-376a与NFAT的表达在正常人与患者组织中存在负相关。3.荧光素酶报告基因检测结果验证了 miR-939和miR-376a对NF-κ B和NFAT确实存在“圈套”作用。这种“圈套”策略使相关炎症因子表达水平降低,紧密连接蛋白表达水平提高。4.动物实验发现,转染人工decoy(NF-κ B、NFAT)组小鼠和转染miRNA-decoy ODN(-939、-376a)组的小鼠相比于UC模型组小鼠来说,肠道炎症反应减轻,肠道通透性降低,KF-κ B p65的表达降低,凋亡相关蛋白表达降低,相关炎症因子表达降低。结论1.在UC患者组织中,miR-939和miR-376a的表达量降低,miR-939与NF-κ B,miR-376a与NFAT的表达在UC患者和正常人组织中呈现负相关。2.miR-939和miR-376a对NF-κ B和NFAT确实存在“圈套”策略,通过抑制转录因子NF-κ B和NFAT的激活,抑制下游炎症与免疫相关的靶基因的表达,提高紧密连接蛋白的表达水平,修复肠道粘膜屏障和抑制肠上皮细胞的凋亡。3.“圈套”策略可抑制小鼠肠上皮细胞凋亡,降低炎症因子的分泌,修复肠道粘膜屏障,对UC模型小鼠有一定的治疗作用。