巴氏杆菌病(Pasteurellosis)是由多杀性巴氏杆菌引起的一类传染病的总称,见于各种畜禽和人类。牛巴氏杆菌病潜伏期短,传播速度快,死亡率高,常对畜牧业造成重大的经济损失。目前,预防巴氏杆菌病主要用灭活疫苗或弱毒疫苗,这些疫苗起到了一定的积极作用。但是,巴氏杆菌血清型众多,而传统疫苗通常只对同型菌株有较好的保护作用,并且弱毒疫苗还可能造成安全隐患。因此,人们希望研究出一种能对异种血清型菌株提供保护且有安全保证的新型疫苗。本实验室有相关研究表明,多杀性巴氏杆菌的plpE基因具有较高的保守性；并且,国内外均有文献报道,多杀性巴氏杆菌的PlpE蛋白很可能是一种交叉保护性抗原。因此,本研究针对牛源A型多杀性巴氏杆菌CQ2株plpE基因的克隆表达及DNA疫苗的研究进行了以下工作：1、CQ2株plpE基因的克隆表达及其免疫学活性分析扩增牛源A型多杀性巴氏杆菌CQ2株plpE基因(去除信号肽),将扩增的DNA片段命名为e1。测序发现e1第385～387位为TAA(终止密码子),提示CQ2株plpE基因截段表达的可能。以385～387位TAA的存在将e1分为前半段384bp、后半段564bp。扩增后半段基因并将其命名为e2,融合扩增前后两段基因并将其命名为e3。构建重组表达质粒pET30a(+)el、pET30a(+)/e2、 pET30a(+)/e3,转入大肠杆菌BL21(DE3),分别表达约24kD、28kD、44kD蛋白,符合plpE基因截段表达时的推导值。将三种蛋白依次命名为E1、E2、E3。经Western-blot分析,蛋白E1、E3有免疫学活性,而蛋白E2不与用CQ2株攻毒获得的牛阳性血清发生反应。用蛋白E1、E3的抗血清分别与CQ2全菌蛋白、蛋白E1、E2、E3进行Western-blot反应,证实CQ2株plpE基因确为截段表达。对CQ2株和其他多杀性巴氏杆菌菌株的plpE基因进行相似性分析,发现除了本实验室和CQ2株来自同一批病料的CQ1株有截段终止密码子,本实验室其他菌株和GenBank发表的所有多杀性巴氏杆菌都无此现象,说明CQ2株plpE基因的截段表达为特例,不具普适性。2、PlpE蛋白对小鼠的免疫原性用蛋白E1、E3免疫小鼠,连续免疫三次,三免后10d用ELISA法检测抗体,发现两个免疫组的抗体水平都极显著高于对照组,且两个免疫组之间无显著差异。用牛A型巴氏杆菌CQ2、CQ6、B型巴氏杆菌和禽A型巴氏杆菌进行攻毒实验,结果表明两种蛋白都不能保护小鼠抵抗禽巴氏杆菌的攻击,但对其他三种菌都能提供一定保护,蛋白E1对CQ2、CQ6、B型巴氏杆菌的保护率依次为42.9%、57.1%、28.6%,蛋白E3依次为57.1%、71.4%、14.3%。3、DNA疫苗的研究以DNA片段e1、e3为外源基因,以真核表达质粒pcDNA3.1(+)为载体,构建DNA疫苗。用DNA疫苗pcDNA3.1(+)/e1.pcDNA3.1(+)/e3免疫小鼠,连续免疫三次,三免后10d用ELISA法检测抗体,发现两个免疫组的抗体水平都极显著高于对照组,且pcDNA3.1(+)/e3免疫组抗体水平极显著高于pcDNA3.1(+)/e1,但两个DNA疫苗免疫组的抗体水平都极显著低于两个蛋白免疫组。用牛A型巴氏杆菌CQ2.CQ6.B型巴氏杆菌和禽A型巴氏杆菌进行攻毒实验,结果表明两种DNA疫苗都不能保护小鼠抵抗牛B型巴氏杆菌和禽巴氏杆菌的攻击,但能对牛A型巴氏杆菌CQ2和CQ6提供一定保护,pcDNA3.1(+)/e1对CQ2、CQ6的保护率依次为28.6%、57.1%,pcDNA3.1(+)/e3依次为28.6%、42.9%。从小鼠生存曲线走势来看,四种疫苗免疫组都比对照组下降更慢,说明四种疫苗对四种菌都有一定的保护作用,由强到弱依次为：蛋白E3>蛋白E1>pcDNA3.1(+)/e1>pcDNA3.1(+)/e3,这与四种疫苗刺激机体产生抗体的能力基本一致,说明蛋白的保护力比DNA疫苗高,且完整蛋白的保护力比截段蛋白高。