背景:缺血性脑血管病是严重威胁人们生命健康的常见病、多发病。虽然,国内外对该病所作的大量实验和临床研究,使人们对脑缺血损害及药物干预等的认识不断深化,针对该病的不同病理环节进行有目的、分阶段、联合治疗使其预后也有了较大改观,但该病的治疗仍未取得理想效果。因此,寻找新的、针对性的治疗靶点和策略很有必要。目前,对缺血性/再灌注损伤机制的研究主要集中在氧自由基、线粒体损伤、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸、炎症反应和细胞凋亡等方面。其中,缺血/再灌注后的炎症反应是研究的热点。神经元是神经系统的形态和功能单位,具有感受体内、外刺激传导冲动和整合信息的能力。神经元数量庞大,约有1011个,它们通过突触彼此连接,形成复杂的神经网络和通路。脑的不同部位和不同的细胞对缺氧的敏感性不尽相同。各类细胞对缺氧敏感性由高到低依次为:神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞、内皮细胞。脑缺血、脑损伤等多种神经疾病均涉及到神经元的损伤,尤其在脑缺血时,在缺血中心区和半影区存在大量的神经元变性、死亡。神经元作为神经功能的主要承载者和体现者,保护其结构和功能是十分重要的。众多试验表明,脑缺血后ICAM-1、iNOS的表达增强。同时发现,在脑血管疾病尤脑缺血时可引起NF-κB的活化,活化的NF-κB可上调细胞因子、粘附分子、炎性蛋白酶等的表达,造成缺血脑组织的炎性反应加剧,细胞的通透性增高,细胞基质破坏,血脑屏障破坏等最终导致神经元坏死。多数学者认为NF-κB是炎症反应的中心环节。靶向NF-κB的抗炎治疗成为国内外学者的研究热点。恩必普(通用名丁基苯酞软胶囊,NBP)是我国研发的治疗脑血管疾病的一类新药。恩必普的主要成分丁基苯酞是从我国南方的一种水芹籽中提取出来的有效成分,可分为左旋丁基苯酞(l-NBP)、右旋丁基苯酞(d-NBP)及消旋丁基苯酞(dl-NBP),有全新的作用机理,可以增加缺血区的脑血流,重建缺血区微循环,缩小脑梗塞面积,保护线粒体,改善脑缺血后能量代谢,减轻局部脑缺血所致的脑水肿等。有研究提示丁基苯酞可以明显降低缺血再灌时脑损伤区的中性粒细胞数目,并可以抑制缺血区的细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和肿瘤坏死因子(TNF-α)表达的升高,d-NBP还可以降低低氧/复氧、IL-1所致的中性粒细胞-内皮细胞粘附,l-NBP能够明显抑制iNOS表达和NO的合成。丁基苯酞(NBP)是否可以通过抑制NF-κB的活化,进而影响其靶基因的转录抑制ICAM-1和iNOS蛋白的表达发挥抗炎作用而保护神经元,是我们研究的重点。目的:(1)探讨大鼠大脑皮质神经元的培养方法并对之进行形态学观察;(2)建立一种方便、稳定、可靠的体外细胞氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)/复氧(reoxygenation)模型(3)通过该模型,研究神经元在氧糖剥夺/复氧后NF-κB p65的表达、活化的动态规律;(4)研究NBP对神经元在该模型条件下细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和诱生型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达的影响。方法:取Wistar大鼠乳鼠脑组织,采用筛网过滤、胰酶酶消化、离心等技术获取大脑皮质神经元并进行培养,通过倒置显微镜、免疫细胞化学进一步鉴定,采用细胞培养、MTT法、酶学检查、光学显微镜等研究和评价氧糖剥夺模型;采用MTT法、酶学检查观察丁基苯酞的保护作用;采用免疫细胞化学和RT-PCR方法研究NF-κB的动态变化及丁基苯酞对其靶基因蛋白ICAM-1、iNOS表达的影响。结果:(1)经形态学、免疫细胞化学(NSE)鉴定所培养的细胞为神经元;(2)OGD前后细胞形态结构变化显著,MTT法及乳酸脱氢酶的释放量测定均提示神经元损伤随氧糖剥夺时间呈时间依赖关系,与正常对照组有显著差异(P<0.05);(3)免疫细胞化学显示神经元的NF-κB p65蛋白表达在OGD4h时开始明显增加(P<0.05);R4h、R8h逐渐增加,R8h时达到高峰(P<0.05);R12h时有所下降,但仍高于正常组(P<0.05);R24h时进一步下降,稍高于正常组,与正常组无显著性差异(P>0.05)。NF-κB核转位细胞R8h达到高峰,与正常对照组有显著差异(P<0.05),且各组间(R4h、R8h、R12h、R24h)差异显著(P<0.05)。OGD/R前NF-κB p65大多数集中于胞浆,细胞呈“空泡”现象,OGD/R后NF-κBp65大多数集中于胞核,细胞呈“实心”现象;(4)MTT法和LDH释放测定发现在OGD4h/R8h时丁基苯酞各浓度组可增加神经元的细胞活力和减少神经元LDH的释放(P<0.05);(5)免疫细胞化学及RT-PCR检测到在OGD4h/R8h时丁基苯酞各浓度组可显著降低神经元表达ICAM-1、iNOS(P<0.05);(6)不同剂量丁基苯酞(100μmol/l、10μmol/l、1μmol/l、0.1μmol/l)在增加细胞活力、减少LDH的释放及降低神经元表达ICAM-1、iNOS等方面,高浓度组与低浓度组有统计学差异(P<0.05),且丁基苯酞100μmol/l组与PDTC 100μmol/l组有统计学差异(P<0.05)。结论:(1)成功培养出数量多、纯度高的神经元;(2)建立了一种简便、稳定和可靠的体外大脑皮质神经元氧糖剥夺/复氧模型;(3)氧糖剥夺导致神经元NF-κB的快速活化,NF-κB p65蛋白表达在氧糖剥夺4h到复氧24h逐渐升高,复氧8h核转位率最大(P<0.05);(4)MTT法和LDH释放测定发现在OGD4h/R8h时丁基苯酞对神经元有保护作用。(5)丁基苯酞各浓度组均可抑制NF-κB的活化,可能通过影响其靶基因的转录而抑制ICAM-1和iNOS蛋白的表达,从而有效保护氧糖剥夺/复氧中损伤的大脑皮质神经元。(6)丁基苯酞各浓度组间在增加细胞活力、减少LDH的释放及降低神经元表达ICAM-1、iNOS等方面,高浓度组与低浓度组有统计学差异(P<0.05),说明高浓度组比低浓度组更能发挥保护作用,且丁基苯酞100μmol/l组与PDTC 100μmol/l组有统计学差异,说明丁基苯酞100μmol/l组比PDTC 100μmol/l组在抑制NF-κB的活化上作用更强。(7)通过MTT法和LDH释放测定,证实丁基苯酞对大鼠大脑皮质神经元没有毒副作用。