背景与目的:　　 宫颈癌治疗根据患者的临床分期、年龄、一般情况、肿瘤相关因素等决定治疗方案[26]。宫颈癌早期(Ⅰ～ⅡA期)主要采用手术治疗，巨块型4cm的宫颈癌(Ⅰ)B2及ⅡA期的患者术前采用新辅助化疗后手术，局部晚期宫颈癌(ⅡB～ⅢB期)目前采用放化疗同步治疗，晚期(Ⅳ期)多采用化疗加放疗[94,95]。近年来，由于联合化疗的进展，宫颈癌的化疗也从对晚期复发癌的姑息治疗变成宫颈癌综合治疗的重要组成部分。尤其是新辅助化疗因其能够缩小局部肿瘤体积、清除或抑制亚临床转移灶、提高后续治疗的效果，受到日益广泛的关注。然而，即使理想的手术、放疗、化疗等多种方式联合治疗，Ⅲ、ⅣA宫颈癌患者5年无病生存率不到一半。化疗药物耐药是中晚期宫颈癌治疗失败的主要原因。引起药物耐药的原因是多因素的，包括避免凋亡细胞死亡，改变多种药物耐药相关蛋白的表达，改变药物代谢或吸收，和/或谷胱甘肽转移酶过表达。　　 谷胱甘肽转移酶(glutathiones-transferas，GSTs)是一个同源二聚体酶的超基因家族，为重要的Ⅱ相代谢酶，其主要功能是催化谷胱甘肽和化疗药物、致癌物、环境污染物等一系列外来物结合，增加代谢产物水溶性，促进其排出，达到解毒功能。临床应用的许多抗癌药物，如顺铂、阿霉素、卡氮芥、丝裂霉素等都是GSTs的底物。GSTs基因多态性可导致酶活性降低或丧失，从而增高宿主对某些毒物和致癌物作用的敏感性，增加细胞毒作用。药理遗传学和基因组学研究表明，GSTs基因多态性与乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌的发生和化疗耐药相关。　　 Townsend等的研究显示GSTs在肿瘤组织中高表达，导致肿瘤对多种化疗药物耐药，提示GST在原发及继发性耐药中发挥重要的作用。体外活体实验显示，化疗影响GSTsmRNA表达水平。Huang等的研究显示骨肉瘤细胞经DXR或顺铂(DDP)处理后，GSTP1表达上调。GSTP1过表达引起细胞对DXR和DDP耐药。GSTP1抑制引起细胞凋亡和DNA损伤更明显[24]。人胃肠道癌细胞暴露于5-FU或CDDP，引起TS、GST-pi和DPDmRNA的表达上调，上调程度与药物耐药相关[91]。目前，对化疗对GSTmRNA表达的影响集中于GSTπ，而对GSTT1、GSTM1mRNA表达的影响尚未见报道GSTs抑制剂已经形成，并用于调节GSTs高表达的实体肿瘤化疗耐药的调节。其中利尿酸(ethacrynicacid，EA)是GSTs抑制剂的重要代表药。　　 至今为止，唯一的GSTs与宫颈癌化疗相关的报道是SohY等的研究。他们对12例宫颈癌和子宫内膜癌患者化疗前后GSTπ表达进行了观察，尽管他们的研究显示化疗后GSTπ表达阳性与预后差相关，但由于样本例数过小而无统计学意义[65]。因此，GSTs基因多态性及化疗对GSTsmRNA表达的影响和GSTs及其抑制剂在宫颈癌化疗耐药中的作用尚不明确。本研究通过对宫颈癌细胞进行培养和GSTs基因分型，检测GSTsmRNA表达，使用化疗药物对细胞进行处理，观察化疗对GSTsmRNA表达的影响;同时采用化疗药物阿霉素(DXR)、长春新碱(VCR)和GSTs抑制剂EA对宫颈癌细胞进行处理，观察药物对细胞生长和存活，旨在分析GST基因多态性及化疗对GSTsmRNA表达的影响，和GSTs及其抑制剂在宫颈癌化疗反应中的作用。　　 材料和方法:　　 1.宫颈癌细胞培养　　 Hela、Siha、C-33A为宫颈癌细胞，贴壁生长;Siha、C-33A培养于含10％FBS、1％谷氨酞胺的DMEM培养基中;Hela培养于含10％FBS、1％谷氨酞胺的RPMI-1640培养基中;所有实验用细胞均于37℃、5％CO2、湿度为95％培养箱中培养。　　 2.细胞GSTs基因分型　　 抽提细胞DNA，采用特异性引物进行PCR扩增分别识别GSTM1/GSTT1野生型和空白等位基因，获得GSTT1/GSTM1完整的基因分型(GSTT1/M1+/+、+/-、-/-);测序分析GSTP1基因序列，使用SequenceScannerSoftwarev1.0分析序列图，确定GSTP1基因型(Ile105Ile、Ile105Val、Val105Val)。　　 3.RT-PCR检测GSTsmRNA表达　　 抽提细胞总RNA，逆转录成cDNA后，采用GSTs特异性引物进行PCR扩增，琼脂凝胶电泳检测PCR产物。　　 4.荧光定量PCR检测GSTsmRNA表达　　 抽提细胞总RNA，逆转录成cDNA后，以GAPDH为内参，以SYBGREEN为染料，进行PCR扩增，通过相对定量以2-ΔCt值代表基因的相对表达强度。　　 5.化疗药物对宫颈癌细胞株体外生长的抑制作用　　 化疗药物的细胞毒作用采用MTS分析方法检测。在确定每孔合适的细胞数目和药物浓度后，将Hela、Siha、C-33A以每孔细胞数分别为1.5×103、4×103、1×104接种于96孔板中，每孔细胞悬液体积50μl。次日上午待细胞贴壁后加药，每孔药液体积50ul，共100ul，每个药物浓度设5个复孔，同时设置空白组（培养基、MTS），对照组（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTS）。分别培养0、24、48和72小时。每孔中加MTS20ul，于37℃、5％CO2、湿度95％的培养箱中再培养4小时。酶标仪OD490nm处测量各孔的吸光值(OD值)，以相对应OD比值表示细胞增殖能力大小。　　 6.化疗对GSTsmRNA表达的影响　　 采用DXR处理细胞Hela、C-33A，分别在加药后24、48小时后收集细胞，采用荧光定量PCR检测GSTsmRNA表达。根据不同浓度不同时间点构成5组，分别为对照组、低浓度24小时组（L24组）、高浓度24小时组（H24组）、低浓度48小时（L48组）、高浓度48小时组(H48组)。对照组不加任何药物;低浓度组药物浓度为DXR0.2uM;高浓度组药物浓度为DXR1uM。在药物作用24、48小时后，收集细胞，采用荧光定量PCR检测GSTsmRNA的表达。　　 7.EA对DXR、VCR细胞毒作用的影响　　 细胞分为4组:空白对照组、DXR或VCR单药组、EA单药组、EA+DXR或VCR组。对照组不加任何药物。每个药物浓度设5个复孔，同时设定空白组。加药后每孔的终体积为100ul。于37℃、5％CO2、湿度95％的培养箱分别培养0、24、48、72小时。每孔加MTS20ul，酶标仪OD490nm处测量各孔的吸光值（OD值），以相对应OD比值表示细胞增殖能力大小。　　 8.统计学分析　　 应用GraphPadPrism5.0软件计算IC50值。所有数据采用SPSS16.0软件进行统计学处理，实验结果以均数±标准差(x±SD)表示。三组及三组以上数据间的比较采用单因素方差分析(ONE-WAYANOVA)分析，如果方差不齐采用Welch方法校正。如差异显著，进一步行多重比较。组间两两比较，方差齐采用LSD方法，不齐采用DunnettT3方法;两组数据之间的比较采用两独立样本t检验(2-Independent-samplesT-test)分析。检验水准α=0.05。当P＜0.05时有显著性差异。　　 研究结果:　　 1.GSTs基因分型　　 1.1PCR分析GSTT1、GSTM1分型　　 GSTT1野生型等位基因PCR产物大小为114bp，空白等位基因为2640bp;GSTM1野生型等位基因PCR产物大小为84bp，GSTM1空白等位基因为14kb。研究结果显示GSTT1野生型等位基因PCR显示Hela、C33A细胞都出现了114bp大小目的条带，Siha细胞株未出现114bp条带;GSTT1空白等位基因PCR结果显示Hela、Siha出现1460bp大小目的条带，C-33A未出现条带;GSTM1野生型等位基因显示三株宫颈癌细胞都出现84bp大小目的条带，GSTM1空白等位基因:除Hela外，Siha、C-33A出现14kb大小目的条带。由此，得到Hela、Siha、C-33A细胞株GSTT1基因分型分别为、+/-、-/-、+/+;GSTM1基因分型++/+、+/-、+/-。+/+、+/-、-/-分别代表纯合野生型、杂合型、纯合性缺失型。　　 1.2.GSTP1测序结果　　 Hela、C-33A313位点碱基为A/G，105位点氨基酸密码子为ATC/GTC，即Ile105Val;Siha313碱基为A，105位氨基酸密码子为ATC，即氨基酸Ile，基因型为Ile105Ile。　　 2.RT-PCR检测GSTT1、GSTM1、GSTP1mRNA在3种细胞中的表达　　 RT-PCR分析GSTT1结果显示Hela、C-33A出现133bp大小目的基因条带，Siha未检测到GSTT1mRNA表达;GSTM1结果显示Hela可见108bp大小的条带，Siha、C-33A未检测到GSTM1mRNA表达。三株宫颈癌细胞均表达GSTP1。　　 3.荧光定量PCR检测3种细胞株GSTs的表达　　 荧光定量PCR检测3种宫颈癌细胞株GSTs的表达，结果显示即使同样的基因型，不同细胞间GSTsmRNA表达差异很大，更有趣的是一些携带杂合型细胞中检测不到mRNA的表达。Siha、C-33A细胞株同为GSTM1杂合型(+/-)，却检测不到GSTM1mRNA表达。Siha细胞GSTP1为纯合野生型，Hela、C-33A为杂合型，但SihaGSTP1mRNA表达较Hela、C-33A更低。　　 4.DXR对细胞GSTsmRNA表达的影响　　 4.1DXR对C-33A、Hela细胞株GSTT1mRNA表达的影响　　 采用不同浓度DXR对C-33A、Hela处理24、48小时后，C-33A细胞株各处理组GSTT1mRNA表达明显增加，组间比较有统计学差异(F=114.277，P＜0.01)。多重比较结果显示，四个处理组中除了H24组与对照组比较无显著性差异外(P＞0.05)，其他三个处理组的GSTT1mRNA表达均显著高于对照组(P＜0.01);Hela细胞株在L48组GSTT1mRNA表达稍增加外，其余处理组较对照组表达量减少。与对照组比较，H48组显著低于对照组(P＜0.05)，其余组间无显著性差异(P＞0.05)。　　 4.2DXR对C-33A、Hela细胞株GSTM1mRNA表达的影响　　 采用不同浓度DXR对C-33A、Hela处理24、48小时后，C-33A细胞株各处理组GSTM1mRNA表达明显增加，组间比较有统计学差异，P＜0.01。与对照组比较，H24、组L48组、H48组有统计学差异，P＜0.05;L24组无统计学差异，P＞0.05。Hela细胞L48组GSTM1mRNA较对照组增加，但差异无显著性，P＞0.05。L24组、H48组GSTM1mRNA表达明显低于对照组，P＜0.05。　　 4.3DXR对C-33A、Hela细胞株GSTP1mRNA表达的影响　　 采用不同浓度DXR对C-33A、Hela处理24、48小时后，C-33A细胞株各处理组GSTP1mRNA表达明显增加，组间比较有统计学差异(F=35.24，P=0.001)。与对照组相比，L24组无显著性差异(P＞0.05)。H24组、L48组、H48组GSTP1mRNA表达均显著高于对照组(P＜0.05)，以H48组表达最高，均显著高于其他处理组((P＜0.05));H24组、L48组无显著性差异(P＞0.05);Hela细胞H24组GSTP1mRNA表达较对照组明显增加，L24组、L48组、H48组表达量减少，各组间比较有显著性差异(F=4.34，P=0.027)。与对照组比较，H24组显著高于对照组(P＜0.05)，其余处理组与对照组无明显差异(P＞0.05)。　　 5.DXR、VCR对宫颈癌细胞的抑制作用　　 DXR、VCR以时间和浓度依赖模式降低Hela、Siha、C-33A宫颈癌细胞的生存能力，随着浓度的增加和作用时间的延长，DXR、VCR对细胞的生长抑制作用不断增加。通过GraphPadPrism5.0软件计算IC50值，对药物IC50进行比较。DXR对三种细胞抑制作用的IC50分别为0.357±0.133、0.982±0.282、2.052±1.194uM，三组数据比较具有统计学差异(F=7.231，P=0.009)。VCR对三种细胞抑制作用的IC50分别为5.852±2.502、43.08±9.199、37.958±7.162uM，三组数据比较具有统计学差异(F=43.3，P＜0.001)。由此可知，携带野生型，表达GSTM1mRNA的Hela细胞对DXR、VCR最敏感，而GSTP1、GSTT1mRNA高表达的C-33A显示对药物不敏感。Siha细胞株对DXR较C-33A敏感(P=0.019)，而对VCR则较C-33A敏感性差，但无统计学差异(P=0.297)。　　 6.EA对宫颈癌化疗疗效的影响　　 EA联合DXR、VCR组在24、48、72小时对Hela细胞的抑制作用明显强于DXR、VCR或EA单药组(P＜0.05)。　　 结论:　　 1.不同浓度化疗药物处理后，细胞GSTT1、GSTM1、GSTP1mRNA表达增加，上调程度与药物耐药相关。　　 2.携带野生型，表达GSTM1mRNA的Hela细胞对DXR、VCR最敏感，而GSTP1、GSTT1mRNA高表达的C-33A显示对药物不敏感，提示GSTs多态性在宫颈癌化疗反应中起作用。　　 3.EA联合DXR、VCR组在24、48、72小时对细胞的抑制作用明显强于VCR或EA单药组，该结果显示GSTs抑制剂EA可增强宫颈癌的化疗疗效。