肝脏是药物代谢分解的主要器官,目前药物上市临床前的药理毒理学研究主要在动物模型上展开,有时与临床试验结果还存在很大差异,因此建立一个人源化的肝脏模型来进行药物的有效性和安全性评估是大势所趋。因此本实验将肝Hepa RG细胞、肝星状细胞、人脐静脉内皮细胞和原代库普弗细胞四种人源化的肝细胞按照人体内肝实质细胞和非实质细胞的真实比例进行混合共培养,建立了一个体外三维肝脏细胞模型。培养初期利用活细胞荧光探针染色技术分别对三种肝非实质细胞进行染色,追踪其在接种后的分布情况。结果表明,康宁低吸附球型板可以在2 h左右使接种后的细胞聚集在板底中央,在培养的24 h左右细胞开始在三维层面上聚集生长,且生长过程中不同细胞始终呈均匀分布。利用生化分析仪对培养过程中收集的细胞上清液进行肝功能分析,结果表明该三维模型至少可以在十一天内维持稳定的肝细胞功能,且总蛋白含量随培养天数的增加而增加。培养后期将三维小球制成石蜡组织块后,将其切片,进行HE染色后观测发现四种细胞依旧均匀分布在球体内部。模型建立后进行了化合物肝毒性评价,在肝细胞小球培养的第五天,检测了在肝毒性阴性药阿司匹林和肝毒性阳性药马兜铃酸作用下,模型的乳酸脱氢酶释放量和细胞活力,并利用RT-PCR技术检测了阳性药不同给药剂量和不同给药次数后药物代谢酶CYP3A4、CYP2E1、UGT1A1、药物转运体MRP2、NF-κB信号通路和肿瘤抑制基因p53的基因表达量变化。结果表明,细胞模型对阿司匹林无毒性反应,随着给药浓度升高乳酸脱氢酶的释放量和细胞活力都没有变化,马兜铃酸对肝细胞模型的毒性呈剂量依赖和时间依赖型,给药浓度和给药时间的增加都使肝细胞活力降低,且重复给药后的药物代谢酶基因表达量结果也与给药浓度呈正相关显著上调。NF-κB和p53基因重复给药后的显著上调也说明该阳性药重复给药后会使细胞内产生炎症且增加了癌变风险。随后又分别建立了小分子肝代谢阳性药NDMA和大分子肝代谢阴性药贝伐珠单抗在细胞培养上清中的LC-MS检测方法,利用建立的肝细胞模型研究药物在肝脏中的代谢速率。经方法学验证后证明贝伐珠单抗在0.2-50μg/m L的范围内具有良好的线性关系,单次和重复给药后的第2、第4、第6和第24 h,细胞培养上清中的贝伐珠单抗含量无变化,且葡萄糖、尿素、总胆汁酸、白蛋白、谷氨酰转移酶和碱性磷酸酶等肝细胞功能指标都没有变化;NDMA在20~1000 ng/m L的范围内具有良好的线性关系,单次给药后NDMA在肝细胞内的代谢速率随浓度的增加而增加,肝脏清除率在给药浓度为600 ng/m L时可以达到8.403。RTPCR结果说明,肝脏对NDMA的代谢不通过CYP3A4和CYP2B6这两个药物代谢酶,但在给药后的前15 min,CYP2E1的表达量显著上调,推测NDMA的代谢通过该肝药酶并且代谢速度很快。同时长期暴露在NDMA中还会导致p53基因上调,诱发细胞癌变。综上所述,实验成功建立了一个能够在体外进行药物肝毒性预测和药物肝脏清除率预测的模型,灵敏度高于二维肝细胞模型,并且可以作为人源化模型对临床前的药理毒理学评价提供一个新的具有参考价值的工具。