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我国是养牛大国，但由于多种传染病的影响，严重制约了养牛业的发展，如：奶牛乳腺炎、口蹄疫、牛病毒性腹泻等。研究表明，重组牛干扰素(boIFN-)在体外具有抗水疱性口炎病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒等多种病毒的作用。干扰素广泛的抗病毒和多种免疫调节功能，使干扰素对重大传染病具有一定的预防和控制作用。高效表达高活性的boIFN-将有利于疾病的预防和控制。巴斯德毕赤酵母表达系统作为一种成熟的真核表达工具，已成功高效分泌表达多种蛋白，本研究采用毕赤酵母高效分泌表达牛干扰素并进行活性分析研究，为牛干扰素的大规模应用奠定了基础，为牛常见疾病的预防和控制提供了实验依据。本研究首先对boIFN-基因进行优化，主要通过密码子偏嗜性优化，G+C含量调整，AT富含区调整等几个方面。将优化后的opti-boIFN-基因克隆于毕赤酵母专用分泌型表达载体pPIC9K，构建重组质粒pPIC9K-opti-boIFN-，电转毕赤酵母感受态GS115，通过MD板（营养缺陷型）和不同浓度的YPD-G418板筛选阳性克隆进行诱导表达，取诱导上清SDS-PAGE电泳、western blot分析。同时采用单因素实验方法，分别摸索最佳诱导条件，优化发酵条件：培养转速、培养温度、甲醇诱导浓度、诱导时间和转接浓度。采用his蛋白纯化柱纯化boIFN-，检测boIFN-的分泌浓度。最后取诱导上清和纯化boIFN-分别在VSV-GFP/MDBK和VSV-GFP/IBRS-2抗病毒系统中进行抗病毒活性检测，与同系统表达的poIFN-在上述系统中进行抗病毒活性比较分析。结果表明：优化后的boIFN-与原基因蛋白序列一致，优化后基因与原序列核酸同源性为73.1%，修改优化碱基134bp，共涉及110个氨基酸的编码，调整后的G+C含量为39.7%。优化基因opti-boIFN-克隆于载体pPIC9K中，测序鉴定重组质粒pPIC9K-opti-boIFN-构建成功。取诱导上清SDS-PAGE电泳发现：19kD处出现蛋白条带，与boIFN-大小相符，western blot鉴定发现，19kD处出现特异性条带，筛选获得高效分泌表达菌株。优化最佳诱导条件为：250r/min，26℃培养，1%甲醇浓度诱导，1.0OD/mL（2%转接量）转接浓度，诱导72h，浓度检测诱导上清中boIFN-最高可达200μg/mL。重组菌诱导上清和纯化boIFN-分别进行水疱型口炎病毒（VSV）抗病毒活性检测，发现诱导上清boIFN-和纯化boIFN-在MDBK细胞中抗病毒活性分别为2106AU/mL和107AU/mg，诱导上清boIFN-和纯化boIFN-在IBRS-2中的抗病毒活性分别是1105AU/mL和5105AU/mg，比较分析发现boIFN-在MDBK和IBRS-2细胞中均具有较高的抗病毒活性。本研究采用毕赤酵母高效分泌表达牛干扰素，为牛干扰素的产业化生产和临床应用奠定了基础。