白细胞介素-7（Interleukin-7,IL-7）是骨髓和胸腺基质细胞产生的一种具有多种生物学效应的细胞因子,在启动、维持和调节免疫应答、促进淋巴细胞发育、分化、增殖和稳态调节等方面具有至关重要的作用。尽管人和哺乳动物的IL-7已被广泛研究,但对禽类特别是鸡白细胞介素7（chIL-7）的研究还非常缺乏,虽然重组chIL-7已有报道,但其是否具有促进鸡淋巴细胞增殖的生物学活性尚不明确。此外,为了研究chIL-7的功能,也急需能够识别和检测天然chIL-7的方法。本研究通过原核和真核表达制备了具有生物学活性的重组chIL-7,以其为免疫原,通过杂交瘤技术制备了可特异性识别天然chIL-7的单克隆抗体,在此基础上,建立了检测chIL-7的抗原捕获ELISA方法,为chIL-7的生物学功能与应用奠定了基础。具体研究内容如下:1.chIL-7的重组表达与生物学活性鉴定根据GenBank中收录的chIL-7基因序列,设计特异性引物,提取鸡胸腺细胞总RNA,通过RT-PCR扩增得到完整的chIL-7和信号肽缺失的chIL-7（sd-chIL-7）。分别克隆至表达载体pCAGGS和pGEX-4T-1,对获得的重组质粒（pCAGGS-chIL-7和pGEX-sd-chIL-7）进行酶切与测序鉴定,序列分析结果表明,chIL-7基因与GenBank上已有的chIL-7基因序列具有99.82%的同源性。将pGEX-sd-chIL-7转化至E.coli BL21（DE3）中诱导表达,进行SDS-PAGE分析,结果发现,重组chIL-7融合蛋白（GST-chIL-7）大小为44kDa,与预期结果一致,其表达量可达6.5mg/L菌液;将pCAGGS-chIL-7转染BHK-21细胞,经间接免疫荧光（IFA）与Western-Blotting鉴定表明,重组chIL-7在BHK-21细胞和上清中成功表达,大小为25 kDa。将GST-chIL-7和pCAGGS-chIL-7转染上清分别与鸡外周血单个核细胞（PBMC）共培养,利用CFSE标记结合流式细胞术检测发现,原核和真核表达的重组chIL-7均能促进鸡淋巴细胞的增殖,表明重组表达的chIL-7蛋白具有生物学活性。2.抗chIL-7单克隆抗体的制备与鉴定将纯化的重组蛋白GST-chIL-7免疫小鼠,通过杂交瘤技术筛选获得了 9株稳定分泌抗 chIL-7 的单抗,分别命名为 1A8、2D10、2E12、2F9、2H3、3B9、4B3、5E5、5F7。Ig 亚类鉴定发现,2F9、2H3、3B9、5E5、5F7 为 IgG1,2D10 为 IgG2a,1A8、4B3 为IgG2b,2E12为IgG3,抗体轻链均为κ链;间接ELISA测得腹水效价均大于1:409600;Western-Blotting和IFA鉴定发现,所获得的单抗均能特异性识别原核和真核表达的chIL-7 蛋白,其中 7 株单抗（1A8、2D10、2E12、2F9、2H3、4B3、5F7）能特异性地识别激活的鸡胸腺和脾脏细胞表达的天然chIL-7蛋白。结果表明,所制备的抗chIL-7单抗有识别chIL-7天然构象的能力,可用于chIL-7检测方法的建立。3.chIL-7抗原捕获ELISA检测方法的建立利用亲和层析柱纯化抗体,并将抗体标记生物素（Biotin）,通过抗体配对试验确定单抗5F7作为捕获抗体,4B3作为检测抗体。经棋盘滴定法确定捕获抗体最佳包被浓度为4 μg/mL,检测抗体最佳稀释度为1:25600,最佳包被条件为4℃包被12 h,最佳封闭液为1%BSA,检测抗原孵育时间为37℃ 1h,检测抗体最佳孵育时间为37℃1h,以重组chIL-7作为标准品进行梯度稀释,结果显示最低检测浓度为4 ng/mL,该方法与实验室制备的其他重组抗原无交叉反应。运用此方法检测有丝分裂原刺激与未刺激的鸡胸腺细胞上清,发现刺激组有更高浓度的chIL-7,含量可达20 ng/mL。上述结果表明,所建立的chIL-7抗原捕获ELISA具有特异性和一定的灵敏性,为chIL-7的检测与功能研究奠定基础。综上所述,本研究制备了具有生物学活性的重组chIL-7蛋白,并以其为免疫原,通过杂交瘤技术制备了可特异性识别天然chIL-7的单抗,在此基础上,建立了检测chIL-7的抗原捕获ELISA方法,为chIL-7的生物学功能研究与应用奠定了基础。