橡胶籽中β-葡萄糖苷酶的分离纯化及性质研究

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近年来,p-葡萄糖苷酶在纤维素降解、食品增香中有广泛的应用前景而备受关注。β-葡萄糖苷酶与植物生氰糖苷的降解也关系密切。橡胶籽含有较高的生氰糖苷,且不易除去,而p-葡萄糖苷酶在橡胶籽中的生氰糖苷降解为关键因子,有望建立高效的橡胶籽脱氰方法。本论文研究了橡籽中β-葡萄糖苷酶的测定条件,提取工艺,分离纯化及酶学性质。以pNPG为底物,研究橡胶籽中β-葡萄糖苷酶的最适测定条件。探讨了反应温度,时间,底物浓度,缓冲液pH值,缓冲液类型对橡胶籽中p-葡萄糖苷酶活力测定的影响,确立最适测定条件为:0.1mL适度稀释粗酶液,使反应最终吸光值在0.1-1.0范围内,0.3mL pH6.0磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液,0.1mL10mmol/L pNPG体系,在42℃下反应30min,于400nm测定对硝基苯酚含量。选用Plackett Burman实验设计,对9个可能影响橡胶籽中p-葡萄糖苷酶的提取的因素进行考察,筛选出pH,料液比,匀浆时间三个显者因素,并在单因素基础上,进行中心复合实验设计,考察总活力与比活力两个指标,确定最佳提取条件:pH8.6,料液比12.6:1,匀浆时间63.6s。比较盐析,聚乙二醇6000沉淀,有机溶剂沉淀,等电点沉淀四种方法初步纯化橡胶籽中β-葡萄糖苷酶的效果,综合考虑回收率与比活力两项指标,确定丙酮沉淀为较为合适的方法。经过丙酮沉淀,离子交换层析,疏水层析后可以得到电泳一条带的p-葡萄糖苷酶,其分子量为65kDa,比活力由最初的3.03U/mg提高到173.21U/mg,纯化倍数达57.16。多数金属离子均对酶活力有一定伤害,Ag+影响最大,Ba2+,Zn2+也有较大影响,Na+,K+,Fe2+无明显影响。乙醇,甲醇,丙三醇,异丙醇,甲醛,丙酮,吡啶,乙酸乙酯等有机溶剂均对p-葡萄糖苷酶活力有伤害,丙三醇伤害最小。尿素,维生素C可抑制酶活力。已纯化的橡胶籽β-葡萄糖苷酶在60-65℃迅速失活,橡胶籽p-葡萄糖苷酶粗酶液可耐受50℃,橡胶籽粉中的p-葡萄糖苷酶可耐受90。C。在贮藏过程中p-葡萄糖苷酶损失不大。已纯化的橡胶籽p-葡萄糖苷酶在pH5-9性质稳定。橡胶籽p-葡萄糖苷酶水解二糖能力微弱,可水解pNPG,苦杏仁苷,水杨苷等糖苷,不能水解IPGT。橡胶籽β-葡萄糖苷酶与橡胶籽中氰苷的分解有关,无酶条件下橡胶籽中氰苷热稳定性较好,橡胶籽中的氰苷含有亚麻苦苷。橡胶籽胚芽中β-葡萄糖苷酶含量较高。
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