生物法生产壬二酸的初步研究

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本文主要对壬二酸生产用菌的菌种改造及菌株的菌学特性、摇瓶发酵条件、小分子效应物对壬二酸生物转化的影响、糖效应及补料发酵、壬二酸的提取精制及检测方法进行了初步研究。以热带假丝酵母(Candida tropicalis)TSW-1为初发菌株,利用离子注入法对其进行诱变处理,离子束注入后,菌株的存活曲线表现为相似的“马鞍型”,通过不同种类、不同能量的离子束注入对比实验,发现40KeV的N+在500×1014ions/cm2剂量下效果较好;运用对照平板和指示剂平板筛选壬二酸突变菌株,获得了壬二酸高产菌株TSW-35,在500ml的三角瓶、装液量为30ml、摇床转速100r/min、发酵温度为30℃的条件下,发酵4d,壬二酸的产率为35.75g/L,同时证明了离子束注入作为一种新型诱变源具有良好的诱变效果。通过对比,确定了酸碱沉淀法提取壬二酸,并用滴定法测定壬二酸的分析方法,其相对误差小于1.5%。在壬二酸的发酵过程中,通风量、尿素浓度、烷烃浓度、培养基的pH值、培养温度等对壬二酸的产率影响显著;在采用挡版式三角瓶的条件下,对发酵培养基进行优化,确定最佳培养基配方为:蔗糖3%、尿素0.14%、九碳烷烃15%;摇瓶最佳发酵工艺为:发酵过程中控制pH值7.5~8.0、培养温度31℃、种子种龄42~44h、接种量15%,此时,壬二酸的产率达50.00g/L。发酵过程中小分子效应物对壬二酸产率具有较大的影响,苯巴比妥与烷烃一样能诱导P450酶的产生;丙烯酸、乙酸钠均能抑制菌体的β氧化;添加吐温80或回收烷烃有利于菌体吸收和转化烷烃;在发酵后期添加蔗糖或补加烷烃有利于菌体生物转化产生壬二酸。在发酵培养基中添加0.1%丙烯酸、发酵48h后补加1.0%的蔗糖和0.5%的烷烃,继续发酵,直至发酵终了,壬二酸产率达到62.00%g/L。从壬二酸的发酵液回收烷烃,加热加碱,初步沉淀蛋白质,并过滤出去菌体,再用活性炭脱色除杂,调节pH值,使壬二酸结晶析出,过滤得到壬二酸粉末。
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