昭通天麻共生优良蜜环菌的筛选及特性研究

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蜜环菌(Armillaria mellea (Vahl: Fr.) P.Kumm.)是一类具有重要经济价值的高等真菌,除部分菌株侵染树木,造成林木根腐病外,蜜环菌即是著名的食用菌,又具有很高的药用价值,是名贵中药天麻(Gastrodia elata)和猪苓(Grifola umbellala)栽培业必备的共生菌,其优劣直接影响天麻和猪苓产量。云南省昭通市因其独特的地理条件和植被资源,造就了昭通天麻特有的品质,该地区被公认为我国天麻地道药材产地。本研究对分离自昭通地区的15株蜜环菌进行优良菌株的筛选、培养条件优化以及与天麻亲和力等方面的研究,以期为昭通天麻共生密环菌菌种培育和昭通天麻产业向现代化、专业化、规模化发展奠定基础。本实验的主要研究结果如下:(1)对昭通本地分离获得的15株天麻共生蜜环菌的生长特性进行研究,并与1株外地优良天麻共生蜜环菌京-234进行对比。结果发现:各菌株生长速度存在明显差异,菌索平均生长速度从高到低依次为京-234、SNA04、SNA01、SNA11、SNA03、SNA09、SNA05、SNA02、SNA14、SNA10、SNA15、SNA12、SNA13、SNA07、SNA06、SNA08;菌丝和菌索萌发时间、菌索颜色、粗细、分枝状况及荧光强度等生长特性表现最好的是SNA04,其次分别为SNA03、SNA01、SNA05、SNA09、SNA11和SNA02,其余菌株的培养特性均无突出表现。综合评价,15株昭通本地蜜环菌中,菌株SNA04性状最优,SNA03菌株次之。(2)选取2株萌发菌、2种菌材和8株蜜环菌与乌天麻进行组合栽培,测定天麻种子的萌发状况及天麻的产量与数量。发现本地萌发菌SNm-01拌播天麻种子后萌发数量较多;菌材Ⅱ发菌拌栽天麻效果明显好于菌材Ⅰ;8株蜜环菌中,总的以本地蜜环菌SNA04拌栽天麻后得到的产量和数量较为稳定且效果较好。所有组合中,以“石斛小菇-菌材Ⅱ-SNA09”组合得到的天麻产量最高,达1.63Kg/穴,以“石斛小菇-菌材Ⅱ-SNA04”组合得到的天麻数量最多,达205个/穴。(3)SNA01、SNA04和京-2343株菌的rDNA-ITS序列分析及同源性比较结果显示,SNA01的ITS序列与芥黄蜜环菌(Armillaria sinapina)具有96%的同源性;菌株SNA04的ITS序列与高卢蜜环菌(Armillaria gallica)具有99%的同源性;京-234和蜜环菌(Armillaria mellea)具有97%的同源性。初步确定SNA01为芥黄蜜环菌,SNA04为高卢蜜环菌,京-234为蜜环菌。(4)采用单因素试验和正交试验法,以生物量为考察指标,对2株昭通本地天麻共生蜜环菌(SNA03、SNA04)菌索生长条件进行筛选。结果显示:2株菌菌索生长的最适温度为25℃,暗培养下菌索生长速度最快;单糖(葡萄糖)为两菌株生长的最佳碳源,有机氮中的酵母膏和蛋白胨为最佳氮源,最适无机元素为K2SO4(SNA03)和KH2PO4(SNA04),最适维生素为VB2;最佳营养条件组合为A1B3C1D1,即葡萄糖︰酵母膏︰K2SO4(SNA03)/KH2PO4(SNA04)︰VB2=15g/L︰3g/L︰2g/L︰0.005g/L),其中氮源(酵母膏)是影响菌索生长的最主要因素。(5)在Plackett-Burman试验设计结果基础上,采用响应曲面法对蜜环菌菌索培养条件进行分析、优化。得到各因素的最佳培养基组成为(g/L):葡萄糖46、乙醇24、酵母膏5、蛋白胨13、K2SO42、KH2PO41、VB20.03、VB10.01。3次重复模型产量验证Y1=4.86g、Y2=4.62g、Y3=4.89g,均值4.79±0.15g与预测产量Y=4.88g相近,验证实验确定了模型的稳定性。(6)用SNA04作菌种,栎树枝条作主要培养基,不同浓度梯度的葡萄糖、乙醇、酵母膏、蛋白胨和土豆汁作辅助营养源培养蜜环菌栽培种。结果显示,与对照相比,加入辅助营养源后,菌索生长速度提高,菌株生长状况得到改良,表现为菌索长势旺、分枝多、色白、粗壮等。其中,菌索在加有250g/L土豆汁菌种瓶中长势最强,平均生长速度达到了1.29cm/d,比对照中的菌索生长速度快0.48cm/d,且土豆是昭通地区主产作物,具有较高产量,可以将其作为蜜环菌栽培种的辅助营养源加以利用。(7)针对蜜环菌菌索极易退化问题,采用不种方法对其进行保藏,结果发现保藏法Ⅲ的保藏效果最好,SNA04菌株在4℃下可存活两年以上且存活率达100%。将已严重退化的蜜环菌菌索接种于4种复壮培养基上进行复壮,生活力均有一定提高,其中1号培养基复壮效果最好,复壮后菌索的生长速度是对照菌索生长速度的1.98倍,且菌索色白、粗壮。
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