油基对脂质伴随物细胞抗氧化的影响研究

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植物油含α-生育酚、γ-谷维素和甾醇等活性成分,它们作为植物油中常见的微量脂质伴随物,具有良好的抗氧化功能。植物油中占比最高的甘油酯因具有不同长度和饱和度的碳链,在性质上存在较大差异,此差异是否会影响脂质伴随物在细胞中抗氧化功能的发挥,机理为何,尚未明晰。鉴于此,本论文选取两种典型植物油基,富含长碳链不饱和脂肪酸甘油酯的稻米油(RBO)和富含中碳链饱和脂肪酸甘油酯的椰子油(CNO),通过高压均质法制备成乳液,将含有不同浓度脂质伴随物的油基乳液递送至HepG2细胞中,在细胞模型中研究不同类型油基乳液对α-生育酚、γ-谷维素和甾醇三种脂质伴随物的细胞抗氧化活性(CAA)的影响及机理。论文的主要研究内容如下:首先,优化高压均质工艺条件,选取稻米油和椰子油两种典型油脂,制备均匀稳定乳液,研究油脂组成对乳液zeta电位、粒径分布和储藏稳定性等性质的影响。结果显示,植物油浓度为100 mg/mL时,乳液平均粒径较小,且多分散系数(PDI)值最小可低于0.2;随着均质压力和循环次数的增大,乳液平均粒径减小,在250 nm-300 nm范围内;均质压力为60 MPa且循环次数为3时,乳液平均粒径在250 nm左右,PDI值低于0.2,zeta电位为-30 m V,乳液体系均匀稳定。具有长碳链不饱和甘油酯的稻米油乳液的zeta电位值显著低于具有中碳链饱和甘油酯的椰子油乳液的zeta电位值(p<0.05);粒径分布图中,三种稻米油(RBO-D、RBO-P和RBO-S)乳液的液滴尺寸分布是单峰且峰宽随脂质伴随物含量增大而逐渐扩大,而两种椰子油(CNO-C和CNO-J)乳液的液滴尺寸分布是单峰且峰宽狭窄,即稻米油更易形成较大液滴;4℃下储藏25 d,稻米油乳液的平均粒径变化不明显,然而椰子油乳液的平均粒径增大约8%,即稻米油乳液的物理储藏稳定性优于椰子油乳液。其次,构建评价乳液抗氧化功能的HepG2细胞模型,通过细胞摄取和二氯荧光素(DCF)细胞荧光信号标记证实HepG2细胞可有效评价乳液体系中脂质伴随物的抗氧化功能。细胞摄取实验数据显示,与空白细胞组(C16:0/C18:2=2.92)相比,稻米油(C16:0/C18:2=0.46)乳液处理的细胞内(C16:0/C18:2=1.08)显著减小(p<0.05),椰子油乳液处理的细胞内C12:0/C16:1由0.67显著增加到23.13(p<0.05);处理1 h,1.6%的γ-谷维素进入细胞;油红O染色后,乳液处理后的HepG2细胞形态相对平滑,且出现鲜红色脂滴;脂肪酸/伴随物数据和形态学表征结果证明油脂已通过乳液导入细胞。在HepG2细胞中,稻米油乳液和椰子油乳液以剂量依赖性方式抑制DCF氧化产生的荧光增加,R2均大于0.9,表现出良好的剂量-效应关系,稻米油乳液和椰子油乳液的半数有效浓度(EC50)分别为5.87 mg/mL(RBO-D)、4.63 mg/mL(RBO-P)、0.58 mg/mL(RBO-S)、4.58mg/mL(CNO-C)和6.40 mg/mL(CNO-J),CNO-C乳液的CAA值与RBO-P乳液的CAA值无显著差异(p>0.05),但显著高于RBO-D乳液的CAA值(p<0.05);400μM浓度H2O2诱导的氧化应激模型下乳液处理后的细胞内抗氧化酶活结果显示,CNO-C和CNO-J乳液处理后的细胞谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)酶活显著大于RBO-P乳液的(p<0.05)。最后,通过制备层析柱脱除脂质伴随物获得油基,将不同浓度脂质伴随物反添至纯化油基中,研究油基对脂质伴随物细胞抗氧化的影响,进一步选择三油酸甘油酯(GLT)和中链甘油酯(MCT)两种理想化油基阐明脂质伴随物在不同类型油基中的细胞抗氧化机理。结果显示,α-生育酚和γ-谷维素在CNO油基乳液中的CAA unit值均显著高于其在RBO油基乳液中的(p<0.05),甾醇的CAA unit值在RBO油基乳液中随含量升高呈现逐渐增大的趋势,而在CNO油基乳液中无显著变化(p>0.05)。然而,不同于细胞体系,α-生育酚在RBO油基乳液中的氧自由基吸收能力(ORAC)值显著高于在CNO油基乳液中的ORAC值(p<0.05),γ-谷维素和甾醇在两种油基乳液中的ORAC值均无显著差异(p>0.05)。进一步验证,α-生育酚和γ-谷维素的细胞摄取量表现为在GLT油基乳液中的显著大于在MCT油基乳液中的(p<0.05),但CAA unit值表现为在MCT油基乳液中的显著大于在GLT油基乳液中的(p<0.05)。因此,长碳链不饱和脂肪酸甘油酯(RBO油基和GLT油基)较中碳链饱和脂肪酸甘油酯(CNO油基和MCT油基)更有利于α-生育酚和γ-谷维素的细胞递送;但由于具有不饱和键的甘油酯易被自由基攻击,需要抗氧化剂参与,从而导致α-生育酚和γ-谷维素在长碳链不饱和脂肪酸甘油酯中较在中碳链饱和脂肪酸甘油酯中反映出更低的细胞抗氧化能力。综上,脂质伴随物在中碳链饱和甘油酯中的细胞抗氧化能力相较于在长碳链不饱和甘油酯中的细胞抗氧化能力更高。
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