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阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)是以认知障碍和人格改变为临床特征的神经退行性疾病。目前,其发病原因尚不明确,缺乏有效治疗手段。调查结果显示,老年女性AD的发病率明显高于男性,提示雌激素的缺失可能影响中枢神经的相关功能,大量研究表明雌激素具有明确的神经保护作用,能够防治AD,但副作限制其广泛应用。植物雌激素(Phytoestrogen,PE)来源于天然植物,不仅具有雌激素样作用的双向调节,而且还具有良好的安全性。有望成为人工合成雌激素的替代物,用于AD的临床治疗。柚皮苷和山柰酚是具有植物雌激素活性的药物,故本实验选用柚皮苷及山柰酚为受试药物,探讨植物雌激素对AD的影响。目的:本文用Aβ25-35损伤的PC12细胞建立AD体外细胞模型,以具有植物雌激素活性药物-柚皮苷和山柰酚为受试药物,采用GC-MS细胞代谢组学方法,分析给药前后AD细胞模型的内源性代谢物变化,找出潜在生物标记物,阐明山柰酚和柚皮苷保护神经损伤的作用机制。方法:1.采用不同浓度的Aβ25-35损伤PC12细胞,MTT法检测细胞活力,确定最佳损伤浓度,建立AD体外细胞模型。2.以盐酸多奈哌齐和雌二醇作为阳性对照,MTT法检测细胞活力,评价柚皮苷和山柰酚对Aβ25-35损伤的PC12细胞的保护作用。3.将PC12细胞样品进行硅烷化柱前衍生化处理,对样品处理过程中的淬灭方法、破碎方法、提取剂、肟化条件、衍生化条件进行优化,选取最佳条件,建立PC12细胞代谢产物的GC-MS分析方法,获得稳定的PC12细胞代谢物谱。4.将空白组、模型组和药物干预组的PC12细胞代谢物谱分别利用NIST05a标准质谱库检索,对PC12细胞中的代谢产物进行准确的定性分析。采用MZmine将得到的质谱信息转化为可供分析的数据,利用SIMCA-P12.0对内源性代谢物数据进行PCA模式识别、PLS-DA分析,挖掘潜在的生物标记物,并利用SPSS11.5对潜在生物标记物的相对峰面积进行t检验分析,观察空白组、模型组和药物干预组潜在生物标记物的趋势变化。采用生物化学和生物信息学数据库,对差异代谢产物进行生物信息学分析,寻找差异性代谢物的代谢通路,构建与神经保护作用之间的联系,深入解释柚皮苷和山柰酚抗AD的作用机制结果:1.与空白组比较,20μM Aβ25-35(P<0.01)作用PC12细胞24h以后,可作为AD早期病理损害的细胞模型。2.与模型组(Aβ损伤组)比较,10-1μM的山柰酚(P<0.01)和10-1μM的柚皮苷(P<0.01)对Aβ25-35损伤的PC12细胞具有明显的保护作用。3.通过比较峰面积和峰个数,得出最佳样品处理方法为:细胞进行液氮淬灭,提取剂为1.5m L乙腈-水(4:1,V/V),破碎条件为用超声细胞破碎。此方法共检测出方法共检测出524个PC12细胞代谢物。4.GC-MS分析方法建立了稳定的PC12细胞代谢物谱,利用SIMCA-P 12.0对内源性代谢物进行PCA模式识别、PLS-DA分析。结果确定了27种潜在生物标记物:甘氨酸、乙酰胺、乳酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、磷酸、氨基丙二酸、脯氨酸、D-苹果酸、L-丝氨酸、苯丙氨酸、α-酮戊二酸、1.4-丁二胺、柠檬酸、3-羧基丁酸、亮氨酸、L-苏氨酸、肌醇、肌醇、乙酸、硬脂酸、胆固醇、棕榈酸、尿苷、α-D-吡喃葡萄糖、油酸酰胺、核糖磷酸。这27种潜在生物标记物所在的代谢通路如下:(1)甘氨酸,丝氨酸,苏氨酸代谢;(2)丙氨酸,天门冬氨酸和谷氨酸的代谢;(3)脂肪酸代谢;(4)苯丙氨酸代谢;(5)缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸的生物合成;(6)半乳糖代谢;(7)磷酸肌醇代谢;(8)精氨酸和脯氨酸代谢。结论:本研究基于GC-MS代谢组学方法,通过对空白组、模型组、药物干预组差异代谢物进行比较研究,结合多变量统计分析方法,筛选出AD细胞模型及药物作用的潜在生物标记物,通过其代谢通路的深入分析,探讨山柰酚和柚皮苷保护神经损伤的作用机制,这对于AD的治疗药物研究提供了理论基础。