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背景:弓形虫(Toxoplasma)是一种专性胞内寄生的顶复门原虫,可感染人类及所有的温血动物,是一种重要的人畜共患病原体,对人类健康及畜牧业生产都构成较大危害。弓形虫属下仅刚地弓形虫(T.gondii)一个虫种,但对其种群遗传结构的研究表明,世界各地的弓形虫存在着丰富的遗传多样性。在北美和欧洲流行的主要基因型为经典的Type1,Type2和Type3型,三者其在小鼠体内表现为强、中、弱不同的毒力特征。我国流行的弓形虫基因型有异于全球其他大陆的克隆谱系,其优势基因型为Chinese1型(ToxoDB#9),在该基因型内有强(代表虫株TgCtwh3)、弱(TgCtwh6)不同的毒株。既往对于弓形虫毒力因子及其多态性的研究主要集中在经典的Ty pe 1、Type 2和Type 3型弓形虫,而对我国代表性基因型弓形虫的毒力决定因子及其作用机制却知之甚少。本课题组前期对我国这两个代表性弓形虫虫株的转录组和基因组进行了分析,发现二者在既往我们认为与经典基因型毒力相关的几个效应分子(ROP18、ROP5、ROP16、GRA15)的基因结构和转录水平均没有明显的差异,但转录组测序分析却发现MIC1的转录水平在强毒株TgCtwh3内显著增高。MIC1是一种微线体蛋白,可与弓形虫的另外两种微线体蛋白MIC4和MIC6形成复合体(MIC1-MIC4-MIC6),在弓形虫入侵宿主细胞的过程中发挥着重要作用。另外,最新的研究还发现MIC1可与小鼠树突状细胞和巨噬细胞的TLR2和TLR4受体结合导致细胞因子风暴和宿主死亡,发挥重要的免疫调节功能。据此,我们推测MIC1在TgCtwh3和TgCtwh6内的差异表达可能是与二者的毒力差异有关。目的:研究MIC1在我国弓形虫优势基因型Chinese1不同毒力株TgCtWh3(强毒)和TgCtWh6(弱毒)中的差异表达情况,探讨其差异表达与Chinese1基因型毒力的关系。方法:(1)MIC1在TgCtwh3和TgCtwh6间转录水平的差异:TgCtwh3株和TgCtwh6株小鼠腹腔传代,并收集速殖子数量达到1×107以上,用TRIzol、氯仿抽提RNA,逆转录成cDNA,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,以β-tublin为内参基因,2-△△CT法计算MIC1等靶基因在TgCtwh3或TgCtwh6体内的相对转录水平。(2)MIC1多克隆抗体的制备及验证:运用Optigene TM密码子优化分析平台对MIC1功能区的编码序列进行密码子优化,合成优化后的编码基因,并将其克隆入pET30a原核表达载体,构建pET30a-MIC1重组质粒;重组质粒转化入大肠埃希菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达重组蛋白,经His亲和层析纯化后以His单克隆抗体为一抗进行Western blot鉴定。用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,抗体纯化后分别运用ELISA和Western blot对其效价和特异性进行分析。(3)MIC1在TgCtwh3和TgCtwh6间表达水平的差异:收集TgCtwh3和TgCtwh6速殖子数量达到1×107以上,提取蛋白后,通过Western blot检测其在蛋白水平上的表达,以弓形虫actin为内参计算相对表达水平。(4)MIC1差异表达对Chinesel弓形虫入侵能力的影响:HFF细胞lx106进行12孔板铺板,待细胞贴壁后长至70%-80%,取HFF内新鲜裂解的速殖子,分别加入 3x106个速殖子,分组为 TgCtwh3、TgCtwh6、TgCtwh3+Anti MIC1,感染后2小时,固定细胞,以兔源抗弓形虫GAP45为一抗,羊抗兔Alexa Fluor 488为荧光二抗标记胞外未入侵弓形虫,透膜后,再以GAP45为一抗,羊抗兔Alexa Fluor 594为二抗来分别标记细胞内和细胞外的速殖子,随机挑选荧光显微镜下拍摄的10个视野,计算出胞内的速殖子占总的速殖子的比例,以此计算入侵效率。结果:(1)qRT-PCR结果显示TgCtwh3虫株中MIC1基因转录水平是TgCtwh6虫株中的3.05倍。(2)通过Optigene TM密码子优化分析平台对MIC1的优化,我们获得基因表达效率更佳的MIC1编码基因,成功地构建了 pET30a-MIC1重组质粒,并获高效表达,重组MIC1的相对分子质量为60kd。纯化后的MIC1多克隆抗体浓度达到2.5 mg/ml,ELISA法检测其效价为1:12800。该MIC1多克隆抗体可以识别重组菌表达的MIC1以及弓形虫代表虫株RH、TgCtwh3和TgCtwh6表达的天然MIC1蛋白,不识别重组菌表达MIC4和MIC6以及ROP18和疟原虫、血吸虫表达的天然蛋白。(3)Western blot 结果发现,MIC1 在 TgCtWh3 中蛋白 MIC1 在 TgCtwh3 中的相对表达值是1.67,在TgCtwh6中的相对表达值是0.72,TgCtwh3中MIC1的表达量是TgCtwh6中MIC1的表达量2.31倍(4)TgCtwh3的入侵的效率为67%,TgCtwh6的入侵效率为43%,TgCtwh3+AntiMIC1的入侵效率为40%。TgCtwh3的入侵效率要高于TgCtwh6,p<0.01但是在TgCtwh3组加入MIC1多克隆抗体可显著降低入侵效率。p<0.001结论:TgCtwh3虫株中,MIC1基因的转录水平和表达水平明显高于TgCtwh6虫株。制备的MIC1多克隆抗体可以特异性识别不同弓形虫虫株的MIC1蛋白和重组表达的MIC1蛋白。TgCtwh3虫株在HHF中的入侵效率要高于TgCtwh6虫株,且MIC1多抗能显著降低TgCtwh3的入侵。