眼局部用药是治疗眼科疾病的主要手段之一。多年来,眼用剂型多是溶液剂,混悬剂和半固体制剂。这些传统剂型的主要缺点是眼部的生物利用度很低。由于眼球的运动和鼻泪系统的作用使药物在角膜前停留时间很短,角膜的屏障作用以及药物本身的理化性质也使药物的跨角膜转运受到限制,通常小于5％的药物能够进入到眼睛的前房组织(如房水等),而分配到后房组织(晶体、玻璃体等)的药物则更少。因此,滴眼液需多次反复给药,应用很不方便,特别是对于眼科手术后的患者。所以研究新型眼部药物载体以改善眼部的吸收、提高眼部生物利用度是非常必要的。 立方晶(Cubosomes,CS)是两亲性脂质和表面活性剂在水中自发形成的双连续相的立方液晶的纳米分散体系,属于自稳定体系。立方液晶在控释药物和蛋白质具有很大的优势,这是因为其独特的脂水双连续相和双水通道结构,能够同时增溶亲水、亲脂及两亲性分子；非特定脂酶的生物可降解性；高生物粘附性；温和的制备工艺,可高压高温灭菌。近期研究发现其双连续型结构与人体皮肤角质层的生物相似性,这可能是立方晶在透皮释药中具有促透作用的原因。因此,我们首次尝试将其用于与皮肤角质层结构相似的眼角膜。 本实验首次制备环孢素A(cyclosporine A,CysA)的立方晶,并首次将其用于眼部角膜给药,评价其角膜穿透特性。同时,制备了CysA的微乳凝胶和纳米粒两种胶体分散体系,结合常用的橄榄油溶液,体外评价了角膜透过能力,考察多种胶体剂型对CysA角膜透过的影响。 首先建立了离体透角膜释放实验中接受液和角膜中CysA的HPLC测定方法。考察药物浓度对CysA透角膜行为的影响,发现随着给药剂量(浓度)的增加,药物累计透过量和透过速率增大,但是药物角膜透过系数减小。 根据伪三元相图筛选适宜的眼用微乳凝胶处方,最终采用亚油酸乙酯/吐温80/甘油/水系统,选择吐温80：甘油(2:1)和吐温80：甘油(3:1)处方中的凝胶区域,采用自微乳化方法制备含1％CysA的眼用微乳凝胶。CysA的测定波长为214nm,接近紫外区,微乳辅料对其测定的干扰较大,所以我们采用反相高效液相色谱法测定其含量。 研究了纳米沉淀法制备纳米粒的工艺。通过单因素试验设计考察了有机溶剂、水相与有机相体积比、PLGA浓度、药物浓度、搅拌速率、溶剂挥发温度对粒径、载药量以及包封率的影响。结果表明,纳米粒制备中的有机溶剂、水相与有机相体积比、PLGA浓度对纳米粒的粒径有明显影响,可以通过改变这些因素来控制微球的粒径。有机相中PLGA浓度和药物浓度对纳米粒包封率影响明显。我们优选处方工艺,用纳米沉淀法制得纳米粒粒径为140nm,载药量为4.8％,包封率为79.5％。 我们采用高压均质的方法,以MO/F127/H2O制备了立方晶分散体系。并制备含1％CysA(w/w)的立方晶分散体系。利用冷冻透射电镜、小角度X射线衍射和原子力显微镜确证了立方晶结构。马尔文动态激光光散射法测得空白立方晶的粒经为173.1nm,多分散系数0.175;含药立方晶粒经为193.5 nm,多分散系数0.199,呈对数正态分布。凝胶微柱离心法可有效的分离包封药物和游离药物,适用于包封率的测定,包封率均可达到90％以上。HPLC法测定含量。以温度加速实验考察了立方晶分散体系的稳定性,空白、0.5％CysA和1％CysA立方晶分散体系在60℃时放置10天,保持稳定。以粘度为表征,初步讨论了含水量增加体系由层状液晶到立方液晶到立方晶的转变。 以CysA橄榄油溶液为对照制剂,采用离体家兔眼角膜对微乳凝胶、纳米粒和立方晶分散体系的角膜渗透性进行了研究,在给药6h以后还考察了角膜中药物的贮存量。结果表明,CysA立方晶和纳米粒分散体的累计透过量都比对照橄榄油溶液组高(P<0.05),角膜透过速率分别是对照橄榄油溶液组的1.52倍和1.48倍(两组之间没有显著差异P>0.05);立方晶组的角膜贮存药量明显高于其他各组(P<0.01),为橄榄油组的2.2倍。但两个微乳凝胶处方的角膜渗透性和贮存药量均低于橄榄油滴眼液(P<0.01)。 考察了三种制剂对家兔角膜的刺激,结果CysA的立方晶和纳米分散体基本无刺激性,两个处方的微乳凝胶和橄榄油溶液对眼部都有一定的刺激性。 首先建立了家兔眼角膜和房水的LC-MS测定方法。采用Kromasil C18(2.1×150mm,5μm)柱,流动相为乙腈：10mM醋酸铵(pH5.3)=90:10,流速为0.2ml.min-1,进样量为5μL。质谱电离方式:ESI+;扫描方式:SIM;用于定量的离子:m/z 1224.8(CysA)和m/z 1238.8(CysD)。药代动力学研究,24只家兔,分别多剂量应用环抱素橄榄油溶液和立方晶分散体系,于用药后不同时间点处死家兔,抽取房水,分离角膜并称重,采用LC-MS法分别测定房水和角膜中药物含量。结果立方晶组较橄榄油组吸收快,消除慢,生物利用度高出约50％；角膜贮存药量初期高于橄榄油组,后期两者近似。 以LEWIS大鼠作为受体,WISTAR大鼠作为供体,建立了原位角膜移植排斥模型,观察抑制大鼠角膜移植排斥反应的疗效。动物被随机分成3组,第一组为空白对照组,术后不接受CysA治疗；第二组术后给予1％CysA橄榄油滴眼液；第三组给予1％CysA立方晶分散体。角膜移植手术后,即进行眼局部给药,剂量为每次20μL,每天5次,10天以后每天3次。术后第1天开始,每天将在裂隙灯下检查植片,观察两周,以后每周观察2-3次,观察4周,同时观察其角膜植片的存活时间。对角膜浑浊,水肿及新生血管3项指标按照Hooland方法进行评分,同时进行植片的组织病理学检查。结果表明,1％CysA立方晶分散体可显著降低大鼠角膜移植的排斥反应发生率(立方晶分散体组为37.5％,空白对照组为62.5％,橄榄油溶液为50％)。组织病理学检测结果显示,未处理组的植片内有大量炎性细胞浸润,多数为淋巴细胞,并能见到角膜基质层的新生血管,应用环饱素立方晶组的角膜植片内浸润的细胞明显少于未处理组。提示环抱素立方晶可有效抑制大鼠角膜移植后的排斥反应,疗效优于橄榄油滴眼液。 用FITC作为荧光标记物,制备了0.03％FITC立方晶,以0.03％FITC橄榄油溶液作为对照,在体外透家兔角膜0.5h,1h,2h,3h时取下角膜,OCT包埋,冷冻切片,直接与10×10荧光显微镜下观察并拍照。实验发现空白角膜基本无自身荧光,对照组FITC橄榄油溶液在近2h时在角膜基质层才有部分荧光显示。而立方晶分散体在0.5h就观察到此现象,在2h在整体角膜有有荧光显示,说明立方晶组药物吸收迅速。