抗冻蛋白(AFP,antifreeze protein)是一种可以非依数性降低冰点、抑制体系发生重结晶特性的蛋白质,广泛地分布在鱼类、动物、昆虫、植物以及微生物中,是生命体抵御外界寒冷环境应激性反应所产生的一种蛋白。据报道,AFP具有提高产品质量,提高农作物抗寒能力,提高冷冻体细胞存活率等作用,广泛地应用于食品、生物、临床医学和化工等领域。本文以谷物原料进行筛选,发现冬小麦麸皮中存在AFP,并进一步对冬小麦麸皮抗冻蛋白(TaAFP)进行分离纯化,研究其理化特性、一级结构和二级结构,并以一级结构为基础,探讨TaAFP与冰晶的结合方式,揭示其抗冻机理。论文首先研究了AFP的检测方法。文中比较了目前常用AFP的检测方法,发现差热分析仪法(DSC)具有样品用量小、可以精确控制温度、可以获得准确结果等优点,因此确定DSC法为本文AFP抗冻活性(THA)的检测方法。还进一步研究了影响测定结果的各个因素,考察使用DSC法测定THA的稳定性、重复性和精密度,结果显示DSC法测定样品THA具有较高的稳定性、重复性和精密度,其RSD在0.4 %以下,相对标准偏差为3.84 %。具体的测定程序如下:样品溶解于10 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 8.0)达到最终蛋白浓度1.0 mg/mL,将10μL样品在坩埚中平衡15min后,按照1.0oC/min的速度进行升降温,在保留温度Th时,保持体系的冰晶质量含量占体系的10 % - 90 %(质量分数)。从多种谷物中筛选AFP,并对其进行分离纯化。筛选结果发现在冬小麦麸皮中存在AFP,进一步分别采用传统的分离法、特异性亲和法和条带切割法对冬小麦麸皮抗冻蛋白(TaAFP)纯化,均获得电泳纯的样品。比较三种纯化方法的优缺点:传统的分离纯化方法在AFP或其它活性物质的筛选中具有普遍适用性;特异性亲和分离纯化法将来可能会适用于AFP大规模的粗分离;电泳条带切割法适用于高精度和高纯度样品的纯化和分析。研究了TaAFP的物理与化学性质,结果发现TaAFP中无糖基。氨基酸分析结果推测TaAFP由155个氨基酸残基组成,相对分子质量13085.2。其中,Glycine残基占52.26%(摩尔百分含量),属于富甘氨酸蛋白(GRP)。使用ExPASy数据库检索与TaAFP相关的GRP发现,TaAFP是一种与冷诱导或其它诱导相关的蛋白。TaAFP的变性温度为61.47oC,变性后,THA丧失,属于热不稳定型AFP。TaAFP在微碱性的环境中(pH 7.0-9.0)显示较高的THA,该环境恰好与植物的生理状态环境一致。TaAFP属于Ca2+-dependend AFP,在Ca2+存在的情况下,THA得到增强。TaAFP还具有AFP所应有的亲水性和较高的分配系数(质量分数大于90%)。MALDI-TOF-MS分析结果显示TaAFP的相对分子质量为13637.711,与上述SDS-PAGE和氨基酸分析推测获得的结果基本吻合。进一步采用了结合N-末端测定和肽指纹图谱的分析方法测定TaAFP的一级结构,结果表明其一级结构为:MARKVIALAFLLLLTISLSKSNAAR VKYNGGESGGGGGGGGGGGGGGNGSGSGSGYGYNYGKGGGQSGGGQGGGGGGGGGGGSNGSGSGSGYGYGYGQGNGGAQGQGSGGGGGGGGGGGGGGSGQGSGSGYGYGYGKGGGGGGGGGGDGGGGGGGGSAYVGRHE,测定覆盖度达到100 %。TaAFP的二级结构分别采用圆二色性光谱、拉曼光谱、红外光谱以及生物信息学的预测方法测定。TaAFP中α-helix的含量为10%-15%;β-sheet的含量为10%-20%,random coil的含量为40%-60%。采用分子力学和量子力学的方法研究了TaAFP和(1121)冰晶面的结合情况。计算结果显示蛋白面M1(Met1、Lys4、Gly47、Asn48、Ser50、Gly51、Gly138、Gly139、Gly141、Gly142、Gly143、Gly161、Arg162、His163和Glu164)与冰晶面具有最强的结合能力。其中,静电作用和范德华作用大大超过了氢键的作用。另一方面,运用半经验量子力学的方法AM1和PM3进一步获得了TaAFP与冰晶面的微观相互作用。首先,当TaAFP与冰晶面作用时,蛋白面M1和冰晶之间发生弱轨道相互作用,AM1和PM3的计算结果均显示面M1与冰晶面之间的弱轨道相互作用是最强的。第二,半经验量子力学计算证实TaAFP与冰晶面之间存在电荷迁移,对整个体系而言,电子是从TaAFP迁移到冰晶上。因此,TaAFP与冰晶相互作用增强。第三,键级能的计算结果显示各个蛋白面与冰晶面的键级能基本上相当,其中,M1属于相互作用较强的面。因此,确定蛋白面M1是TaAFP与冰晶的最佳结合面。TaAFP的抗冻机理就在于M1通过库仑作用、范德华作用、轨道重合和电荷迁移等相互作用与冰晶面紧密的结合。当M1与冰晶面结合后TaAFP锚定于冰晶表面,冰晶如果继续生长,则冰晶的表面积需要增加,而冰晶表面积的增加则需要外界进一步提供能量。提供能量后,系统的熵降低,体系温度下降。在宏观上则表现为冰晶需要更低的温度才可以进一步生长,体系的冰点被降低,即产生热滞现象。