姜黄素对小鼠卵巢组织Nrf2蛋白表达的作用

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目的:  随着年龄的增长,卵巢的抗氧化能力逐渐下降,卵巢内环境中氧化与抗氧化反应的失衡,是造成卵巢逐渐衰老的重要原因之一。核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-derived factor 2-related factor 2,Nrf2)是细胞本身抗氧化作用的重要因子,积聚在细胞质中。在受到氧化应激反应的刺激时,Nrf2转移至细胞核内,作用于细胞核内的抗氧化反应原件(antioxidant responsive element,ARE),调节下游多种抗氧化酶的表达,从而减少细胞受到氧化应激反应的损害。姜黄素(curcumin)是提取于姜黄科植物姜黄中的一种色黄、酸性的多酚类有机物,研究发现其具有明显的抗炎、抗氧化的功能,因而成为姜黄发挥药理作用的主要活性成份。由于已研究发现姜黄素在大脑、肝脏、肾脏、肺脏等人体脏器中均发挥着有效的抗氧化作用,因此我们推测可以使用姜黄素通过作用于Nrf2/ARE信号通路而增强卵巢的抗氧化能力,从而延缓卵巢储备功能下降、逐渐衰老的过程。本研究观察了不同周龄的ICR雌性小鼠卵巢自然衰老的过程,通过免疫组织化学染色(Immunohistochemistry,IHC)技术,研究Nrf2蛋白在小鼠卵巢组织中的定位;通过蛋白免疫印迹(Westernblot,WB)及实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-timePolymerase Chain Reaction,QRT-PCR)技术,研究Nrf2在小鼠卵巢中的表达水平的增龄性变化;给予5周龄小鼠不同剂量/时间的姜黄素灌胃处理后,通过WB技术,研究姜黄素对卵巢中Nrf2蛋白表达的影响。从而探索Nrf2蛋白与卵巢衰老之间的关系以及姜黄素是否参与调节Nrf2蛋白的表达而对卵巢衰老存在调节作用。  方法:  根据ICR小鼠的生殖生理节点,选取4日龄、3周龄、8周龄、12周龄和40周龄的小鼠卵巢备用。将不同周龄的卵巢固定、切片后行HE染色,观察不同周龄的小鼠卵巢组织的正常形态;行免疫组织化学染色,观察 Nrf2 蛋白在不同周龄小鼠卵巢中的定位。提取不同周龄小鼠卵巢的蛋白和 RNA,行WB 及QRT-PCR实验,观察Nrf2在不同周龄小鼠卵巢中表达水平的变化。选取50只体重为25±2 g的5周龄ICR雌性小鼠,随机分成5组,予不同剂量的姜黄素灌胃处理,分别为:空白对照组、0mg/kg灌胃组、50mg/kg灌胃组、100mg/kg灌胃组和200mg/kg灌胃组,药物处理3周后,处死小鼠,取其卵巢组织,行WB实验,观察不同剂量的姜黄素对卵巢组织中Nrf2蛋白表达的影响。选取30只周龄为5周,体重为25±2 g的ICR雌性小鼠,随机分成3组,分别用100mg/kg姜黄素灌胃至8周、12周、40周,提取该3组卵巢的蛋白,行WB实验,观察姜黄素的不同作用时长对卵巢组织中Nrf2蛋白表达的影响。  结果:  (1)Nrf2 蛋白在各周龄组小鼠卵巢组织中均有表达,且主要表达在次级卵泡和窦状卵泡的颗粒细胞和卵母细胞中。  (2)各周龄组小鼠卵巢组织中Nrf2的表达水平差异有统计学意义,在近育龄期/育龄期(3周龄/8周龄/12周龄)的表达水平要显著高于幼龄期(4日龄)和围绝育期(40周龄)(P<0.05)。  (3)不同剂量的姜黄素灌胃处理对小鼠卵巢中 Nrf2 蛋白的表达差异有统计学意义, 100mg/kg 及 200mg/kg 灌胃组卵巢中 Nrf2 的表达高于空白对照组、0mg/kg 及50mg/kg组(P<0.05)。而100mg/kg与200mg/kg灌胃组卵巢中Nrf2表达水平差异无统计学意义(P>0.05);空白对照组、0mg/kg 及 50mg/kg 灌胃组卵巢中Nrf2 的表达水平差异亦无统计学意义(P>0.05)。  (4)用姜黄素100mg/kg灌胃处理至8周、12周和40周后小鼠卵巢组织中Nrf2蛋白的表达水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);而该三组卵巢组织中Nrf2蛋白的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。  结论:  在小鼠卵巢组织中,Nrf2蛋白主要表达在次级卵泡和窦状卵泡的颗粒细胞和卵母细胞中。Nrf2在育龄期小鼠卵巢组织中的表达水平高于幼龄期和围绝育期,以及姜黄素可以促进小鼠卵巢组织中Nrf2蛋白的表达,提示Nrf2与卵巢储备功能存在一定相关性,姜黄素可能可以通过调节卵巢组织中Nrf2蛋白的表达,而降低氧化应激对卵巢组织及卵子的损伤,这有可能为应对卵巢储备功能下降提供新的思路。
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