目的:急性心肌梗死是导致人类死亡的重要原因之一。急性心肌梗死后除缺血缺氧引起的心肌损伤外,局部的炎症反应促进心肌细胞焦亡,加速细胞外基质合成,导致心肌纤维化,心室重构,甚至心力衰竭。抗炎治疗能够减少急性心梗后心肌损伤、改善动脉粥样硬化。近年来秋水仙碱对心血管疾病(冠心病、心包炎等)的保护作用逐渐受到重视。但由于大剂量秋水仙碱可能存在不良反应,因此限制了其在临床中的应用。为了克服秋水仙碱的不良反应。本研究运用碳酸钙纳米递药系统装载秋水仙碱,将秋水仙碱运输至心梗部位心肌,从而达到增加秋水仙碱药效,减少不良反应的作用。方法:本研究采用碳酸钙纳米递药系统为载体,装载秋水仙碱,制成秋水仙碱碳酸钙纳米粒。同时,本研究也制备了秋水仙碱纳米粒和碳酸钙纳米粒作为对照。从体外和体内两方面对秋水仙碱碳酸钙治疗急性心梗的效果进行了研究,初步探讨了可能的机制。体外研究部分:以脐静脉内皮细胞和Raw264.7细胞为研究对象,用ox LDL刺激建立细胞损伤模型,并根据药物处理不同分为五组,即对照组(control:无ox LDL及药物刺激)、秋水仙碱组(Col:ox LDL及秋水仙碱刺激)、秋水仙碱碳酸钙纳米组(CCa NPs组:ox LDL及秋水仙碱碳酸钙纳米粒刺激)、碳酸钙纳米粒组(NPs:ox LDL及碳酸钙纳米粒刺激)、模型组(ox LDL:ox LDL刺激,无药物干预)。通过MTT评估不同组别细胞活力,ELISA法检测内皮细胞内TNF-α、IL-1β等炎性因子的浓度,DCFH-DA检测内皮细胞内ROS水平,流式细胞术检测内皮细胞、巨噬细胞凋亡情况。体内研究部分:(1)秋水仙碱治疗剂量选择:分别采用低剂量、中剂量及高剂量的秋水仙碱对急性心梗wistar大鼠进行治疗。观察各组大鼠的食欲、体重变化判断秋水仙碱不良反应,通过ELISA法比较不同剂量秋水仙碱对心梗大鼠血清TNF-α、IL-1β、CRP等炎性因子水平;western-blot检测心梗心肌TLR4、NFκB、NLRP3、Caspase-1、TNF-α、IL-1β等炎性相关蛋白的表达;TUNEL法检测心肌细胞焦亡的情况。根据以上结果筛选合适的药物剂量。(2)秋水仙碱碳酸钙纳米粒的治疗效果:以急性心梗wistar大鼠为研究对象,根据不同的药物干预,将大鼠分为六组:模型组(MI组),碳酸钙纳米粒组(NPs),秋水仙碱组(Col),秋水仙碱碳酸钙纳米组(CCa NPs),秋水仙碱纳米粒组(CNPs)和假手术组(Sham),ELISA法检测血清TNF-α、IL-1β、CRP、LDH水平;Western-blot检测心梗心肌TLR4、NFκB、NLRP3、Caspase-1、IL-10、TGF-β、TNF-α、IL-1β等炎性相关蛋白的表达;TUNEL法检测心肌细胞焦亡;Masson染色检测心肌纤维化的情况;免疫组化法检测CD206、CD11C表达阳性的巨噬细胞以了解巨噬细胞极化的情况。(3)通过检测大鼠肝肾功能及肝肾功能病理结果评估秋水仙碱及其纳米递药系统的安全性。结果:1、秋水仙碱纳米颗粒的表征。马尔文粒径仪测定纳米粒粒径示:秋水仙碱碳酸钙纳米粒、秋水仙碱纳米粒和碳酸钙纳米载体的粒径分别约为243,248和273nm。秋水仙碱碳酸钙纳米粒和秋水仙碱纳米粒的载药量分别是:4.25%,3.5%。2、秋水仙碱和秋水仙碱碳酸钙纳米粒对内皮细胞具有保护作用。MTT结果显示秋水仙碱碳酸钙纳米粒,较秋水仙碱、碳酸钙纳米粒及模型组,可显著提高内皮细胞存活率;Col,CCa NPs可明显降低受损内皮细胞TNF-α,IL-1β水平;CCa NPs可降低受损内皮细胞ROS水平,并且CCa NPs可明显抑制受损内皮细胞凋亡。3、秋水仙碱及秋水仙碱碳酸钙纳米粒明显抑制巨噬细胞凋亡。Col和CCa NPs较ox LDL,NPs组,巨噬细胞凋亡明显减少,并且CCa NPs较Col组可进一步减少巨噬细胞凋亡。4、秋水仙碱适宜浓度中剂量秋水仙碱组(0.2 mg/kg尾静脉注射)较高剂量秋水仙碱组大鼠相比,死亡率低,进食情况好,体重轻度增加;与低剂量、高剂量秋水仙碱组比较,更为显著的抑制CRP、TNF-α及IL-1β等炎症因子水平,减少心梗后心肌TLR4、NFκB、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、TNF-α等炎症相关蛋白表达,并且中剂量秋水仙碱组的心肌细胞TUNEL阳性细胞最少。5、秋水仙碱及秋水仙碱碳酸钙纳米粒抗炎作用研究。CCa NPs、Col组较MI组,可明显降低心梗后大鼠血清CRP、TNF-α及IL-1β等炎性因子水平,CCa NPs抗炎效果优于Col;CCa NPs较MI组TLR4、NF-κB、NLPR3、IL-1β等炎性蛋白表达减少;Col,CNPs和Sham组NFκB相对蛋白表达较MI组明显降低;CNPs和Sham组IL-1β相对蛋白表达较MI组明显降低;CCa NPs和Sham组较MI组,IL-10、TGF-β的抗炎蛋白表达增加;CCa NPs组TGF-β相对蛋白表达明显高于Col组。6、秋水仙碱和秋水仙碱纳米粒通过抑制心肌焦亡改善心肌纤维化。CCa NPs、CNPs和Sham组较MI组,LDH释放明显减少;心梗后心肌TUNEL阳性细胞表达明显降低;CCa NPs、CNPs、Col和Sham组较MI组,Caspase-1表达明显降低。7、秋水仙碱和秋水仙碱纳米粒对巨噬细胞极化的研究。CCa NPs可增加CD206阳性细胞表达,减少CD11C阳性细胞表达,即调控巨噬细胞极化,促进巨噬细胞极化为M2型巨噬细胞;8、秋水仙碱和秋水仙碱纳米粒的安全性评价。CCa NPs、CNPs、NPs组较假手术组、MI组肝肾功能无明显异常,肝肾HE染色无明显异常。结论:1、基于秋水仙碱的碳酸钙纳米递送系统制备成功。2、秋水仙碱碳酸钙纳米粒可通过抑制炎症因子释放、改善受损内皮细胞氧化应激以及减少内皮细胞凋亡的作用达到内皮保护作用。3、0.2 mg/kg秋水仙碱抑制炎症因子,不良反应少,并且抑制心梗后心肌炎性蛋白、改善心肌细胞焦亡作用最强;4、初步探讨了秋水仙碱碳酸钙纳米粒可能通过调控TLR4/NFκB/NLRP3信号通路抑制心肌细胞焦亡和炎症反应;5、秋水仙碱和负载秋水仙碱纳米粒通过抑制心肌细胞焦亡和调控巨噬细胞极化,改善心肌纤维化;6、负载秋水仙碱的纳米粒具有较好的安全性。