目的:肺癌发病率居世界范围恶性肿瘤首位,也是引起恶性肿瘤性死亡的主要原因之一。非小细胞肺癌(NSCLC)约占所有肺癌的80%-85%,腺癌(ADC,约占40%-50%)和鳞状细胞癌(SCC,约占20%-30%)是NSCLC的主要组织学亚型。在临床上,只有一小部分NSCLC患者在早期(I期或II期)就被诊断出来,此时肿瘤可以通过手术切除进行治疗。超过70%的NSCLC患者在诊断时出现局部晚期或转移性疾病(III期或IV期),失去了完全性手术切除的机会。目前晚期NSCLC治疗的主要方式包括化疗、放疗、靶向药物及中医药治疗等。近十年,靶向药物治疗取得了重大突破,已经成为标准治疗方法,明显提高了伴有驱动基因突变的肺腺癌的生存预后,但对于缺少有效治疗靶点的NSCLC患者,总生存期获益有限。并且靶向药物仍无法避免疾病的进展,以及逐渐出现的耐药问题都迫切需要新的治疗方法来改善预后。肿瘤的免疫治疗开启一种新的治疗思路,区别于传统治疗方式,免疫治疗不限于特定病理类型以及靶基因突变的肿瘤,是一种旨在激活人体免疫系统,依靠自身免疫机能杀灭癌细胞和肿瘤组织的抗癌治疗。其中免疫检查点抑制剂是免疫治疗的重要手段之一,主要通过对免疫检查点的阻断作用激活细胞毒性T淋巴细胞,逆转肿瘤细胞的免疫逃逸,进而排除肿瘤。免疫检查点抑制剂疗效突出,已批准应用于恶性黑色素瘤,非小细胞肺癌,肾癌等多种恶性肿瘤的临床治疗中。尽管免疫检查点抑制剂治疗取得了突破性的进展,但只有少数患者(约20%)受益于单克隆抗体治疗,并且在治疗一段时间后仍表现出耐药性,这一现象说明了在肿瘤微环境中免疫检查点作用的复杂性。近期文献显示多个免疫检查点常共表达在肿瘤耗竭的T细胞上,也提示了肿瘤微环境的免疫抑制可能是由多组协同抑制性分子所共同调控的。联合应用免疫检查点抑制剂是一种治疗的可行策略,因此迫切需要寻找新的治疗靶点。BTLA(B/T淋巴细胞弱化因子,B and T lymphocyte attenuator,CD272)是新近发现的一种CD28超家族的免疫抑制受体,是免疫治疗的潜在重要靶点。既往研究发现:BTLA在黑色素瘤中的高表达限制了CD8+T细胞的表达和功能。HSP70疫苗在小鼠宫颈癌模型中下调BTLA的表达可提高其抗肿瘤作用。对BTLA单核苷酸多态性的研究表明,BTLA多态性与乳腺癌的发生和预后有关。BTLA在胃癌组织较癌旁正常组织高表达,与淋巴结转移、肿瘤浸润深度、高级别分化等临床特点相关,是不良预后的影响因子。到目前为止,对BTLA蛋白在NSCLC中的表达和功能知之甚少。因此,本研究旨在探讨BTLA在非小细胞肺癌中的表达情况,及其与免疫检查点PD-1/PD-L1、肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)、临床病理特点以及生存预后的相关性,同时进一步探究BTLA对非小细胞肺癌细胞功能的调控作用及可能的信号传导机制。研究方法:1、BTLA,PD-1,PD-L1,TILs在非小细胞肺癌中的表达情况及相关的生存预后分析。本研究收集中国医科大学盛京医院病理科诊断为NSCLC(I-III期)患者的癌组织及癌旁正常组织石蜡包埋组织切片,整理其临床病理资料及随访无复发生存期和总生存时间,通过免疫组化方法检测BTLA,PD-1,PD-L1在癌组织及癌旁正常组织中的表达情况,再经卡方检测评估各免疫检查点的表达与临床病理特点的相关性,经Spearman统计方法评测BTLA与PD-1,PD-L1,TILs的相关性,再经Kaplan-Meier统计方法分析各免疫检查点的表达情况与患者生存时间之间的关系。2、BTLA在四种NSCLC细胞系中的表达情况利用免疫细胞荧光方法检测BTLA蛋白在四种NSCLC细胞系(A549、H226、H1650、H460)中的表达,Wbstem blot测定四种NSCLC细胞系中蛋白水平的表达情况,选择BTLA蛋白表达较高的的两种NSCLC细胞株用于后续实验。3、沉默BTLA蛋白对NSCLC细胞系生物学行为的影响本研究应用shRNA重组质粒sh-BTLA构建沉默BTLA的A549和H226非小细胞肺癌细胞株,同时设立转染阴性对照的shRNA重组质粒(sh-NC)组和未转染的空白组(Black control)细胞进行对照。实时荧光定量PCR(简称定量PCR)和Wbstem blot测定转染后48h的BTLA表达情况。分别利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)、Annexin V-Alexa Flour 647/PI kit双染细胞凋亡法、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验检测转染sh-BTLA、sh-NC以及Black control的A549和H226非小细胞肺癌细胞株细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭能力。4、沉默BTLA后对EMT转化过程、NF-κB信号通路的影响利用Westem blot分别测定A549和H226非小细胞肺癌细胞株转染sh-BTLA构建的沉默BTLA实验组、转染sh-NC的阴性对照组以及未转染的空白对照组中的EMT信号通路、NF-κB信号通路相关标记物的表达水平。利用免疫荧光技术分别检测两种细胞系(A549和H226)转染sh-BTLA的实验组、sh-NC的阴性对照组以及未转染的空白对照组中NF-κB信号通路中磷酸化的p65的表达水平及分布情况。结果:1、BTLA、PD-L1主要表达在NSCLC中癌组织细胞质及细胞膜上,偶尔散在表达于肿瘤间质淋巴细胞中,PD-1蛋白主要表达于浸润在肿瘤间质内的淋巴细胞胞质中。BTLA在具有淋巴结转移组的表达高于无淋巴结转移组(P=0.045),在肿瘤III期组的表达高于I-II期组(P=0.034)。PD-L1的表达与吸烟(P=0.011)及淋巴结转移(P=0.019)密切相关,其中吸烟者PD-L1表达高于非吸烟者(44.8%VS 17.2%),淋巴结转移组PD-L1的表达高于未转移组(50%VS 25.5%)。而PD-1的表达与各临床病理特点无显著性相关。2、BTLA高表达与PD-L1高表达呈正相关(P=0.011),而与PD-1、TILs的表达无相关性。3、BTLA高表达组较低表达组平均RFS短(P=0.029);PD-L1高表达组较低表达组患者平均RFS和OS都短(P=0.016;P=0.034)。4、BTLA且PD-L1同时高表达组较单一BTLA或PD-L1高表达或两者都为低表达组的患者平均RFS和平均OS更短(P=0.012;P=0.031)。5、细胞免疫荧光方法检测BTLA蛋白表达于NSCLC细胞系(A549、H226、H1650、H460)中,Wbstem blot测定BTLA在四种NSCLC细胞系中蛋白水平的表达情况,筛选出较高表达的A549和H226细胞系用于后续实验。6、定量PCR和Westem blot结果均显示转染sh-BTLA的A549和H226细胞BTLA表达水平明显低于转染sh-NC的细胞以及未转染的空白细胞组(P<0.05)。7、CCK-8增殖实验和Annexin V-Alexa Flour 647/PI kit双染细胞凋亡实验结果显示在A549和H226两种细胞系中转染sh-BTLA的实验组与转染sh-NC的阴性对照组以及空白对照组的细胞增殖和凋亡功能无统计学差异。8、在转染sh-BTLA质粒0h、24h和48h进行细胞划痕实验,实验结果显示转染sh-BTLA的实验组比转染sh-NC的阴性对照组以及空白对照组的细胞迁移能力减弱(P<0.05)。9、在转染质粒48h后行Transwell实验,结果显示转染sh-BTLA的实验组比转染sh-NC的阴性对照组以及空白对照组的细胞侵袭能力减弱(P<0.05)。10、在转染质粒48h后处理细胞提取蛋白,Western Blot结果沉默BTLA的实验组的E-cadherin蛋白上调、N-cadherin蛋白下调、Vimentin蛋白下调、Snail蛋白下调、Slug蛋白下调(P<0.05)。11、加入浓度为5μM的NK-κB抑制剂BAY11-7082在培养基中,培养72小时后收取蛋白行Western blot检测,明显抑制了NF-κB p65的磷酸化,Snail蛋白表达量下降,E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05)。12、在转染质粒48h后处理细胞提取蛋白,Western Blot结果沉默BTLA的实验组的NF-κB磷酸化p65蛋白表达下调、磷酸化IKb-α蛋白表达下调。行细胞免疫荧光实验显示NF-κB p65细胞核转移下调。结论:1、BTLA、PD-L1在非小细胞肺癌癌组织中表达,且高于癌旁组织。BTLA在具有淋巴结转移组的表达高于无淋巴结转移组,在肿瘤分期为III期中的表达高于I-II期患者。PD-L1的表达在吸烟者高于非吸烟者,在淋巴结转移组的表达高于无淋巴结转移组。2、BTLA在非小细胞肺癌癌组织中表达与PD-L1的表达成正相关性。3、高表达BTLA的患者较低表达者RFS更短,高表达PD-L1的患者较低表达者RFS和OS更短。4、同时高表达BTLA和PD-L1的患者预后更差。5、沉默BTLA可能通过抑制NF-κB/Snail信号通路抑制NSCLC细胞上皮间质化,进而抑制NSCLC细胞的迁移和侵袭。