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高龄妇女接受体外受精（in vitro fertilization,IVF）治疗后的成功率明显偏低。其中,卵母细胞老化造成的胚胎发育能力下降,是导致高龄妇女体外受精后妊娠率低、流产率高的重要原因。因此,寻找能够缓解老化卵母细胞IVF后发育受阻的方法具有重要的意义。本实验以过氧化氢（H2O2）处理小鼠卵母细胞建立的氧化应激诱导老化模型为研究对象,研究氧化应激诱导卵母细胞老化后线粒体的相关特征受损与老化卵母细胞IVF后胚胎发育率及质量下降的关系。继而,以老化卵母细胞囊胚发育率和囊胚质量为主要评价指标,并辅于线粒体功能状态,考察褪黑素改善老化卵母细胞IVF胚胎发育率及质量的可行性,为提高临床高龄女性IVF成功率提供实验依据。本研究分别利用10μM、50μM、100μM和150μM不同浓度的H2O2处理MII期卵母细胞3 h,建立以氧化应激为特征的卵母细胞老化模型,以未经H2O2处理的卵母细胞为对照。各组卵母细胞进行标准的IVF后,观察发育效率。结果显示,随H2O2浓度的增加,卵母细胞中的氧化应激程度是明显加剧的。经150μM H2O2处理的卵母细胞IVF后,碎裂率相比对照组显著性升高（7.77±4.78%vs.39.32±9.14%,P<0.05）;100μM H2O2处理后2细胞率相比对照组显著降低（45.63±2.6%vs.54.67±8.27%,P<0.05）;当IVF胚胎发育至囊胚阶段时,50μM、100μM处理组囊胚率分别为26.27±0.06%、28.46±3.45%,均显著低于对照组（34.9±1.77%,P<0.05）。这说明老化卵母细胞中的氧化应激,可能会对IVF后胚胎产生持续的影响,造成发育损伤。在许多细胞类型中,老化往往伴随着明显的线粒体功能损伤,因此我们对H2O2诱导卵母细胞老化的线粒体功能进行了专门的检测。活性线粒体特异性标记探针Mitotracker Red结果显示老化卵母细胞内活性线粒体丰度明显减少;类似地,通过对线粒体基因组（mitochondrial DNA,mtDNA）拷贝数的绝对定量检测,发现随着H2O2处理浓度的升高,卵母细胞mtDNA拷贝数呈现逐渐下降的趋势;此外,使用JC-1探针对线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）检测结果显示,10100μM浓度下表现出MMP升高的趋势,即超极化现象,这种现象是凋亡早期特征性事件,意味着老化卵母细胞已经启动了凋亡的发生。老化卵母细胞中氧化应激对IVF胚胎的持续影响,提示这一过程是可恢复的。因此,我们尝试在体外培养阶段（in vitro culture,IVC）添加褪黑素（melatonion,MT）,通过清除附植前胚胎中的活性氧来缓解老化卵母细胞IVF后的发育损伤。选取了较为温和的100μM H2O2浓度诱导卵母细胞老化,分别在培养液中添加10-5 M、10-7 M、10-9 M三个浓度的褪黑素,评价老化卵母细胞IVF后发育效率和发育质量。结果显示,与老化组（20.87±4.11%）相比,培养液中添加10-9 M褪黑素可以显著恢复囊胚率（29.42±2.39%）,达到与青年卵相当的发育水平（38.76±9.43%）。而10-5 M和10-7 M褪黑素添加则未能改善囊胚率（19.87±2.88%、23.35±6.03%）。这些结果表明IVF后培养阶段添加低浓度的褪黑素可以有效恢复和改善老化卵母细胞IVF后的发育能力。接下来,我们发现10-5 M、10-7M、10-9 M褪黑素添加后,囊胚细胞数分别为28.30±10.42%、31.54±9.97%、39.36±9.78%,均与H2O2处理老化组（37.91±4.25%）差异不显著。进一步,囊胚凋亡检测结果提示,10-9 M褪黑素添加有降低老化卵IVF囊胚细胞凋亡率的趋势,但差异不显著（2.57%vs.3.18%）。我们意外地发现,10-5 M褪黑素会显著增加囊胚细胞凋亡率（6.97%vs.3.18%,P<0.05）,提示高浓度的褪黑素添加会有细胞毒害作用。mtDNA定量结果显示,10-9 M褪黑素添加组与H2O2处理老化组相比,能够显著恢复8细胞阶段mtDNA拷贝数。结论:1)100μM H2O2诱导卵母细胞老化,卵母细胞内线粒体相关特征受损明显,其中线粒体中ROS水平显著升高,活性线粒体丰度和mtDNA拷贝数降低,膜电位超极化现象明显。2)在IVF后的IVC阶段添加10-9M褪黑素可以恢复H2O2引起的线粒体拷贝数降低,提高囊胚率及囊胚质量,从而缓解由H2O2诱导的老化卵母细胞体外受精后发育受阻。