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目的沉默Wnt4基因的表达,观察其阻断Wnt4/β-catenin信号通路的效果,探讨Wnt4 si RNA沉默以延缓肾间质纤维化的可行性,为慢性肾脏病的治疗提供新的理论支持。方法1、根据sh RNA的设计原则,设计4组针对Wnt4基因的有效靶点,筛选出干扰效果最佳的靶点,构建携带Wnt4 sh RNA基因的慢病毒载体,并进行大量包装及滴度测定。2、根据慢病毒液剂量的不同,设计四组(N=3)实验组,每组剂量分别为1×105ifu、1×106ifu、1×107ifu、2×107ifu,注射于大鼠肾被膜下,3天后取新鲜的肾脏组织制作冰冻切片,荧光显微镜下检测慢病毒液感染效率,确定最佳给药剂量。3、128只SD雄性大鼠(7周龄、180-220g)随机分为4组:(1)输尿管分离组(CON组,N=32);(2)输尿管结扎组(UUO组,N=32);(3)阴性沉默组(阴性组,N=32);(4)wnt4基因沉默组(沉默组,N=32)。各组分别于术后第3、7、10、14天各处死8只大鼠,提取肾组织标本,通过电镜、HE染色、Masson染色观察肾脏结构及间质纤维化的改变;通过免疫组织化学染色检测wnt4、β-catenin、α-SMA及波形蛋白的表达部位;通过RT-PCR技术检测wnt4、β-catenin、α-SMA及波形蛋白的m RNA相对表达量。结果(1)成功构建Wnt4 si RNA慢病毒载体,最终滴度测定为4×108TU/ml。(2)冰冻切片:慢病毒液滴度为1×107ifu时感染效率最高。(3)HE染色、masson染色及电镜病理显示沉默组病理损伤较UUO组、阴性组减轻。(4)免疫组织化学染色:UUO组、阴性组及沉默组Wnt4、β-catenin、α-SMA及波形蛋白大量表达于肾小管上皮细胞,肾小球系膜区可见少量波形蛋白的表达。(5)RT-PCR:沉默组wnt4 m RNA相对表达量明显低于第10、14天的UUO组及阴性组(P<0.05);β-catenin m RNA相对表达量与同一时间点UUO组及阴性组相比无显著性差异;α-SMA及波形蛋白m RNA相对表达量较第14天的UUO组及阴性组明显减低(P<0.05)。(6)m RNA相对表达量的相关性分析:UUO组Wnt4与β-catenin、α-SMA m RNA相对表达量均呈显著正相关,沉默组Wnt4与β-catenin m RNA相对表达量无显著相关性,Wnt4与α-SMA m RNA相对表达量呈显著正相关。结论(1)慢病毒载体介导的Wnt4 si RNA可以特异性地下调UUO模型大鼠肾脏Wnt4蛋白及m RNA的表达。(2)在UUO模型中,Wnt4基因被激活,可以通过Wnt4/β-catenin信号通路参与肾小管上皮间质转分化,促进肾间质纤维化的形成。(3)Wnt4基因沉默可降低肾小管上皮间质转分化率,延缓大鼠肾间质纤维化的进程,但对β-catenin的影响不明显,提示Wnt4/β-catenin信号通路非损伤诱发肾小管上皮间质转分化单一通路。