论文部分内容阅读
甲氧基类黄酮是植物体内重要的次生代谢产物,具有抗癌、抗过敏等保健功能。但植物中甲氧基类黄酮含量较低,限制了其直接应用。目前利用重组蛋白进行体外催化合成甲氧基类黄酮越来越受到人们的关注,但植物中大多数O-甲基转移酶的催化特性尚未明确,限制了其进步的利用。本研究以茶树(Camellia sinensis)为试验材料克隆得到5个O-甲基转移酶基因CsOMT1、CsOMT2、CsFOMTl、CsFOMT2和CsCOMT,除CsCOMT外均为首次获得,将其分别进行原核表达,利用重组蛋白分别催化12种类黄酮底物,利用UHPLC-ESI-QTOF/MS及MS/MS对催化产物进行鉴定,明确了其中3个O-甲基转移酶对类黄酮底物的催化特性。本研究取得的主要结果如下：1.利用RT-PCR与RACE技术获得一个O-甲基转移酶基因CsOMTl, cDNA全长1246bp,其开放阅读框1077bp,编码358个氨基酸。推测的蛋白分子量为40.2KD。其核苷酸编码序列与葡萄和毛果杨的类黄酮氧甲基转移酶基因相似性分别为80%、81%。将该基因片段连接到原核表达载体pET-28a中,原核表达的外源蛋白与预期大小相符合。2. CsOMT2cDNA全长1280bp,其开放阅读框1068bp,编码355个氨基酸。其氨基酸序列与葡萄和蓖麻氧甲基转移酶基因相似性分别为73%、71%。将基因片段连接到pET-28a中,原核表达的外源蛋白与预期大小相一致。3. CsFOMT1cDNA全长为1370bp,最大开放阅读框1101bp,编码366个氨基酸。将基因片段连接到pGEX-6p-1中,诱导表达融合蛋白经检测为65KD左右。CsFOMTl可特异性催化山奈酚、槲皮素、芹黄素、木樨草素,其中对槲皮素的相对甲基化活性最高。CsFOMTl可催化芹黄素的5-OH和7-OH发生甲基化,以7-OH为主；可催化槲皮素的3-OH,4’-OH,3’-OH发生甲基化,以3-OH和4’-OH为主；催化山奈酚的3-OH和5-OH发生甲基化,以3-OH为主。4.将CsCOMT基因片段连接到pET-28a中,诱导表达的外源蛋白与预期蛋白大小一致。CsCOMT可特异性催化山奈酚、槲皮素、芹黄素、木樨草素、EGC,其中对山奈酚的相对转化活性最高。对部分底物的甲基化产物进行检测,结果表明,CsCOMT催化山奈酚、芹黄素和槲皮素的主要产物分别为7-甲氧基山奈酚、7-甲氧基芹黄素和3’-甲氧基槲皮素。5. CsFOMT2cDNA全长1287bp,最大开放阅读框1053bp,编码350个氨基酸。将基因片段连接到pET-28a中,诱导表达融合蛋白经检测为40KD左右。CsFOMT2可特异性催化山奈酚、槲皮素,其中对山奈酚的相对转化活性最高。CsFOMT2可特异性催化山奈酚的3-OH,催化槲皮素的4’-OH、3’-OH和7-OH。6.在正离子模式下,利用UHPLC-QTOF-MS/MS对酶促反应产生的甲氧基黄酮醇同分异构体进行检测。由于甲氧基类黄酮上的甲基无论位置如何,均具有不稳定性,因而容易发生断裂丢失。对于甲氧基黄酮醇而言,当甲氧基附近存在相邻的质子时,在能量碰撞下会发生分子内质子转移,从而引起甲烷中性丢失。甲烷中性丢失后的碎片离子([M+H-CH4]+)会提供甲氧基相邻结构的信息,以及甲氧基位点的特异性。此外,甲基化黄酮醇发生RDA裂解,会形成携带甲氧基的RDA碎片离子。质谱信息中的RDA碎片离子和位点特异性碎片离子[M+H-CH4]+可成为快速鉴定甲氧基黄酮醇的同分异构体的诊断模式。结合保留时间,己成功鉴定出10种甲基化的山奈酚和槲皮素。