论文部分内容阅读
内切β-1，4-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)是一种重要的工业用酶，广泛应用于饲料工业，酿造业等领域。随着生产的发展，β-1，4-葡聚糖酶需求量日益增加。本实验的主要目的就是，从分泌热稳定性的β-1，4-葡聚糖酶的黑曲霉高产菌株中，克隆该基因，利用基因工程手段实现高效表达，满足工业生产的需求。
实验首先是利用RT-PCR技术，提取黑曲霉(Aspergillusniger)L3的总RNA进行反转录，并通过PCR扩增得到去除天然信号肽的β-1，4-葡聚糖酶基因egI，将其插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k上，使之位于α-因子信号肽下游，并与之同框，构建重组表达质粒pPIC9k-egI，电击转化毕赤酵母GS115，经MM、MD、CMC-Na和G418平板筛选，得到重组毕赤酵母工程菌1-1＃和1-5＃，在摇瓶发酵水平上，以0.5％的β-葡聚糖为底物检测，酶活分别达到1456U/mL和1928U/mL。重组酶最适pH为5.0，最适反应温度为70℃，在70℃时保温30min后仍然具有90％以上的活力。
为了进一步提高表达量，根据毕赤酵母偏爱的密码子优化来源于AnigerL3的内切β-1，4-葡聚糖酶的DNA序列，共改变193个碱基，G+C％由54％下降到44.22％。设计了14对寡聚核苷酸引物，采用重叠延伸PCR三步法获得全长基因序列共改变。将其插入到毕赤酵母表达载体。pPIC9K上，构建重组表达质粒pPIC9k-syn-egI，电击转化毕赤酵母GS115，经MM、MD、CMC-Na和G418平板以及摇瓶筛选，得到重组毕赤酵母工程菌2－7＃。摇瓶发酵条件下，以0.5％的葡聚糖和1％的CMC-Na为底物检测，酶活分别达到3658U/mL和591.9U/mL；采用50L发酵罐进行发酵，酶活则分别达到65649.6U/mL和39728.32U/mL。