钍对蛋白核小球藻的水生态毒性研究

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目的:  钍是一种天然性放射金属元素,且用途广泛,但是对钍的研究还很少。本次研究的目的主要是研究钍在水中的形态变化以及水生毒性对绿藻生物效应。  方法:  采用蛋白核小球藻为模式生物,参考国际经济合作与发展组织(OECD)化学品生态毒理测试方法,以Th(NO3)4?5H2O为实验材料,研究钍(Th)的水生态毒性。将蛋白核小球藻培养在OECD201营养液中,选取在在对数期的小球藻做实验,用Th(NO3)4?5H2O配置成不同浓度溶液,且将小球藻的浓度调节至2×106个/ml,在温度为24±1℃,光照强度为3000±10%和转速为95±5 r/min的摇床中培养96小时。观察不同浓度下钍(Th)对小球藻的毒性作用:①配置Th(NO3)4?5H2O浓度为100μM的溶液作为母液,再使用OECD201小球藻营养液将其逐级稀释至1.8、3.6、7.2、10.8、14.4μM,并选取OECD原液作为控制组,每组设置三个平行样。使用对数期的小球藻进行为期四天的生长抑制实验,测定不同浓度下,钍对于小球藻的生长抑制效应,测定小球藻OD值,以此估量小球藻的生长状态及数量。  ②小球藻的培养液为OECD201营养液,暴露组营养液是在OECD201营养液中加入 Th(NO3)4?5H2O,为了确定在暴露组中营养液及钍元素的不同化学存在形态平衡图,我们引入了一种复杂的算法 MEDUSA程序用于建设分配图。MEDUSA是由来自瑞典斯德哥尔摩皇家理工无机化学学院的Ignasi Puigdomenech编写此程序基本参数包括必需的平衡常数,用来计算程序中的数据库的分配图。  ③测定生长抑制试验中不同浓度下,钍对于小球藻叶绿素的影响,先用无水乙醇将小球藻中的叶绿素提取出来,然后再用荧光分光光度计检测不同浓度下提取出的叶绿素的荧光值,叶绿素含量和荧光值存在计量关系。  ④测定生长抑制试验中不同浓度下,钍对于小球藻 ROS的影响,使用活性氧试剂盒(DCFH-DA)测定小球藻产生的ROS,并且用酶标仪对每天的变化进行测定。  ⑤将在14.4μM暴露了四天以后的小球藻及控制组的小球藻保留,在4℃的条件用2000r/min离心5min,收集小球藻细胞,制好样后,在扫描电镜(SEM)下观察小球藻外在形态的变化观察其表面形态的变化。  ⑥同SEM操作方法,将在40μM暴露了四天以后的小球藻及控制组的小球藻保留在4℃的条件用2000r/min离心5min,收集小球藻细胞,用戊二醛浸泡24h后然后冲洗逐级脱水,制好样后,用透射电镜观察(TEM)小球藻内部结构的变化。  结果:  1.在小球藻的生长抑制试验中结果表明:随着暴露浓度和时间的增加,小球藻的OD值降低,小球藻数量减少,在外观上,暴露浓度越高的小球藻越趋向沉积于培养液底部,且颜色发黄。  2.查找水平衡化学数据库提供OECD201营养液中的元素化学的数千种化学形态的各类化学反应平衡常数,利用MEDUSA程序来计算在实验条件下Th的形态变化,计算结果发现随着 pH的增大,可溶性的Th+减少,而形成不溶性的Th(OH)4。  3.先用无水乙醇提取小球藻中的叶绿素,然后用荧光分光光度计检测不同浓度下提取出的叶绿素的荧光值。结果显示:荧光值的变化趋势与小球藻生长趋势保持一致,随着浓度的增加和时间的延长,钍对叶绿素的影响增加,叶绿素含量降低。  4.利用活性氧试剂盒与不同暴露浓度下的小球藻反应,再用酶标仪测定其荧光值。结果显示:低暴露浓度组的ROS并无显著影响,高暴露组的ROS明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),随着浓度和时间的增加,ROS含量增高。  5.在扫描电镜(SEM)下观察小球藻外在形态的变化,电镜结果显示:与控制组相比,暴露组的小球藻出现聚齐,萎缩,且表面附着沉淀物,沉淀物的能谱结果显示有钍的存在。  6.用透射电镜观察(TEM)小球藻内部结构的变化,电镜结果显示:与控制组相比,暴露组出现明显质壁分离的现象,且细胞结构变得模糊,细胞质出现萎缩,细胞表面沉积着沉淀物,细胞内也有沉积物的存在,细胞结构遭到明显破坏。  结论:  1.钍在暴露介质中存在着形态变化,pH>6后,钍主要以Th(OH)4的状态存在。  2.钍对小球藻有毒性作用,影响小球藻的生长且可导致其生化指数的改变,导致其叶绿素含量降低和细胞内ROS含量升高。  3.从SEM和TEM结果来看,钍对小球藻的外形和内部结构均有改变,这有可能也是钍的毒性机制之一。
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