阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种以进行性认知障碍和记忆损害为主的中枢神经系统退行性疾病,是老年痴呆最常见的类型。目前的研究显示AD与糖代谢之间存在着密切的联系,各种类型的阿尔茨海默病均伴随着神经元葡萄糖利用率减少,胰岛素通路异常以及能量利用障碍,从而导致神经元功能不足,神经元数量减少、凋亡、坏死,加重AD的进展。因此,近年来对糖代谢异常与AD发病之间关系的研究备受关注。大脑所需的葡萄糖完全来自于循环血,由葡萄糖转运体（Glucose transporter,GLUT）跨血脑屏障转运至中枢神经系统。中枢神经系统神经元当中最重要的两种GLUT亚型分别是GLUT 3和GLUT 4。在AD患者的大脑当中,GLUT 3和GLUT 4的表达水平明显降低,从而导致葡萄糖转运率降低,神经元糖代谢异常,进而发生神经元能量代谢障碍,引起神经元退化,出现AD的相应症状。目前的研究已经证实GLUT 3和GLUT 4的减少可以引起神经元退化,而不是神经元退化导致了GLUT 3和GLUT 4的减少。因此,上调GLUT 3和GLUT 4的表达,增加葡萄糖向神经元中转运从而改善神经元的能量代谢很有可能是防止AD进展的一个重要途径。孕酮（PROG）作为一种重要的神经甾体,是中枢神经系统第四代神经递质,广泛参与人体的多种生理与病理过程。孕酮具有明显的神经保护与改善学习记忆的,提高大鼠海马新生神经元的存活率的作用。更为重要的是,孕酮与AD的发生关系密切。对AD的流行病学临床调查研究证实,AD患者脑内的孕酮水平与正常同龄人相比明显下降,以上研究结果提示孕酮有可能成为延缓AD进展的一个新靶点。本实验室的前期研究已经证实孕酮在AD的细胞模型当中具有抑制神经元凋亡、减轻氧化应激反应、诱导神经干细胞向神经元分化的作用。但是在AD的动物和细胞模型当中,孕酮是否可以促进神经元的葡萄糖摄取能力尚无文献报道。因此,本研究采用APP/PS1转基因小鼠的动物模型和Aβ_25-35诱导的原代培养大鼠皮层神经元AD细胞模型,探讨孕酮对AD神经元葡萄糖摄取能力的影响并研究其具体的分子作用机制。第一部分:孕酮对APP/PS1双转基因小鼠GLUT3、GLUT4表达水平的影响。目的:研究孕酮对APP/PS1小鼠大脑皮层GLUT 3、GLUT 4表达水平的影响。方法:选取APP/PS1小鼠作为AD的动物模型,随机分为正常对照组、APP/PS1组、APP/PS1+孕酮组。APP/PS1+孕酮组小鼠使用孕酮灌胃40天之后进行Morris水迷宫行为学测试,行为学测试结束之后处死小鼠,使用免疫组织化学和Western Blot测定APP/PS1小鼠大脑皮层GLUT 3、GLUT 4的表达水平。结果:1.孕酮对APP/PS1转基因小鼠学习记忆能力的影响Morris水迷宫定位航行实验结果显示,三组小鼠平均游速无显著差异。与APP/PS1组相比,APP/PS1+孕酮组小鼠逃避潜伏期显著缩短（P<0.05）。空间探索实验结果显示,与APP/PS1组相比,APP/PS1+孕酮组小鼠Ⅳ象限停留时间百分比和穿越平台区次数均显著增加（P<0.01）。2. 孕酮对APP/PS1转基因小鼠大脑顶叶皮层组织GLUT 3、GLUT 4表达水平的影响。免疫组织化学实验结果显示,与正常对照组比较,APP/PS1组小鼠顶叶皮层组织GLUT 3、GLUT 4表达水平显著下降（P<0.01）,与APP/PS1组小鼠相比,APP/PS1+孕酮组顶叶皮层组织中GLUT 3、GLUT 4表达水平显著升高（P<0.05）。小鼠顶叶皮层组织提取蛋白进行Western Blot检测,实验结果呈现出相同的趋势。3.孕酮对APP/PS1转基因小鼠大脑顶叶皮层组织GLUT 1、GLUT 2、GLUT 8表达水平的影响。Western Blot检测结果显示,孕酮未对GLUT 1、GLUT 2、GLUT 8的表达产生显著影响。小结:孕酮具有改善APP/PS1小鼠学习记忆能力的作用,并且显著提高了APP/PS1小鼠顶叶皮层GLUT 3、GLUT 4的表达水平。第二部分:孕酮对Aβ_25-35诱导的AD细胞模型神经元葡萄糖摄取能力的影响目的:研究孕酮促进皮层神经元葡萄糖摄取能力的具体分子机制。方法:采用Aβ_25-35诱导的大鼠原代培养皮层神经元作为AD的细胞模型,使用AG205（PGRMC1特异性拮抗剂）和RU486（经典孕酮受体选择性拮抗剂）研究孕酮对原代培养皮层神经元葡萄糖摄取能力的具体分子机制。使用葡萄糖摄取实验测定孕酮对原代培养皮层神经元葡萄糖摄取能力的影响。使用Western Blot和免疫荧光分别测定孕酮对原代培养皮层神经元GLUT 3、GLUT 4表达水平的影响。结果:1.孕酮对原代培养皮层神经元葡萄糖摄取能力的影响葡萄糖摄取实验的结果显示,与正常对照组相比,Aβ显著降低了皮层神经元的葡萄糖摄取能力（P<0.01）。与Aβ组相比,孕酮显著的提升了皮层神经元的葡萄糖摄取能力。AG205可以逆转孕酮诱导的皮层神经元葡萄糖摄取能力的上升,但RU486没有这种作用。2.孕酮对原代培养皮层神经元GLUT 3、GLUT 4表达水平的影响Western Blot的实验结果显示,Aβ显著抑制了原代培养皮层神经元GLUT 3、GLUT 4总蛋白和膜蛋白的表达,与Aβ组相比,Aβ+孕酮组GLUT3、GLUT 4总蛋白和膜蛋白的表达水平显著升高（P<0.01）。AG205则可以逆转孕酮诱导的GLUT 3、GLUT 4总蛋白和膜蛋白表达水平的提升（P<0.01）。免疫荧光的实验结果显示出同样的趋势。小结:孕酮通过激动PGRMC1显著的提高了皮层神经元的葡萄糖摄取能力以及GLUT 3、GLUT 4总蛋白和膜蛋白的表达水平。第三部分:孕酮对APP/PS1双转基因小鼠和Aβ_25-35诱导的AD细胞模型CREB、PPARγ表达水平的影响目的:研究孕酮促进皮层神经元GLUT 3、GLUT 4表达水平上调的具体分子作用机制。方法:选取APP/PS1双转基因小鼠作为动物模型,使用免疫组织化学测定CREB、PPARγ在APP/PS1小鼠大脑皮层当中的表达水平。提取APP/PS1小鼠大脑皮层组织中的蛋白质之后,使用Western Blot测定皮层组织蛋白质当中CREB、PPARγ的表达水平。采用Aβ_25-35诱导的原代培养皮层神经元作为细胞模型。使用AG205研究孕酮对CREB、PPARγ表达水平的影响。提取细胞蛋白之后使用Western Blot测定原代培养皮层神经元CREB、PPARγ的表达水平。在细胞模型中使用666-15（CREB抑制剂）后使用Western Blot测定原代培养皮层神经元GLUT 3的表达水平。在细胞模型中使用GW9662（PPARγ抑制剂）后使用Western Blot测定原代培养皮层神经元GLUT 4的表达水平。结果:1.孕酮对APP/PS1转基因小鼠顶叶皮层组织中CREB、PPARγ表达水平的影响免疫组织化学实验结果显示,与正常对照组相比,APP/PS1组小鼠顶叶皮层组织CREB、PPARγ表达水平明显下降（P<0.01）,与APP/PS1组相比,APP/PS1+孕酮组小鼠顶叶皮层组织中CREB、PPARγ表达水平显著升高（P<0.01）。小鼠顶叶皮层组织提取蛋白进行Western Blot检测,实验结果呈现出相同的趋势。2.孕酮对Aβ_25-35诱导的AD细胞模型神经元CREB、PPARγ蛋白表达水平的影响Western Blot的实验结果显示,与正常对照组比较,Aβ显著抑制了原代培养皮层神经元CREB、PPARγ的表达（P<0.01）,与Aβ组相比,Aβ+孕酮组CREB、PPARγ的蛋白表达水平均显著升高（P<0.01）。AG205则可以逆转孕酮诱导的CREB、PPARγ蛋白表达水平的升高（P<0.05）。3.666-15对Aβ_25-35诱导的AD细胞模型神经元GLUT 3蛋白表达水平的影响Western Blot的结果显示,与正常对照组相比,Aβ可以明显的抑制GLUT 3的表达。与Aβ组相比,Aβ+孕酮组原代皮层神经元GLUT 3蛋白表达水平显著升高（P<0.01）。666-15可以逆转孕酮诱导的GLUT 3蛋白表达水平的提升（P<0.01）。4. GW9662对Aβ_25-35诱导的AD细胞模型神经元GLUT 4蛋白表达水平的影响Western Blot的结果显示,与正常对照组相比,Aβ可以明显的抑制GLUT 4的表达。与Aβ组相比,Aβ+孕酮组原代皮层神经元GLUT 4蛋白表达水平显著升高（P<0.01）。GW9662可以逆转孕酮诱导的GLUT 4蛋白表达水平的提升（P<0.01）。小结:孕酮通过上调CREB的表达从而促进了GLUT 3的表达,孕酮通过上调PPARγ的表达从而促进了GLUT 4的表达。第四部分:孕酮对APP/PS1双转基因小鼠和Aβ_25-35诱导AD细胞模型GLUT 4膜转位的影响目的:研究孕酮诱导GLUT 4膜转位的具体分子机制。方法:选取APP/PS1双转基因小鼠作为动物模型,提取APP/PS1小鼠大脑皮层组织中的蛋白质之后,使用Western Blot测定皮层组织蛋白质当中AS160、P-AS160、AKT、P-AKT的表达水平。采用Aβ_25-35诱导的大鼠原代培养皮层神经元作为AD的细胞模型,使用AG205研究孕酮对原代培养皮层神经元GLUT 4膜转位的具体分子机制。使用Western Blot和免疫荧光分别测定孕酮对原代培养皮层神经元AS160、P-AS160、AKT、P-AKT表达水平的影响。结果:1.孕酮对APP/PS1转基因小鼠顶叶皮层P-AKT、AKT、P-AS160、AS160、蛋白表达水平的影响Western Blot的结果显示,与正常对照组相比,APP/PS1转基因小鼠顶叶皮层中P-AKT、P-AS160的表达水平显著降低（P<0.01）。与APP/PS1组相比,APP/PS1+孕酮组小鼠顶叶皮层中P-AKT、P-AS160的表达水平显著升高（P<0.01）。2.孕酮对Aβ_25-35诱导的AD细胞模型神经元P-AKT、AKT蛋白表达水平的影响Western Blot的结果显示,与正常对照组相比,Aβ诱导的原代培养神经元P-AKT、P-AS160的表达水平显著降低（P<0.01）。与Aβ组相比,Aβ+孕酮组原代培养神经元P-AKT、P-AS160的表达水平显著升高（P<0.01）。AG205可以逆转孕酮诱导的P-AKT、P-AS160表达水平的提升（P<0.01）。免疫荧光的结果显示出了同样的趋势。小结:孕酮提升促进AKT、AS160的磷酸化水平从而促进GLUT 4的膜转位。综上所述,本研究以APP/PS1转基因小鼠作为AD的动物模型,以Aβ_25-35诱导的原代培养皮层神经元作为AD细胞模型,使用免疫组织化学、Western Blot、葡萄糖摄取实验、免疫荧光等实验技术研究孕酮对皮层神经元葡萄糖摄取能力的影响及其具体分子作用机制。实验结果显示,孕酮通过激动PGRMC 1促进了APP/PS1转基因小鼠和Aβ_25-35诱导的AD细胞模型皮层神经元GLUT 3、GLUT 4的表达,从而提高了皮层神经元的葡萄糖摄取能力。进一步研究发现,孕酮提升GLUT 3的表达水平是由于孕酮促进了GLUT 3上游的转录因子CREB的表达,而孕酮提升GLUT 4的表达水平则是由于孕酮促进了GLUT 4上游的转录因子PPARγ的表达。此外,孕酮还具有促进GLUT 4膜转位的作用,其分子作用机制之一是孕酮通过激动PGRMC 1促进了AKT和AS160的磷酸化。