论文部分内容阅读
目的慢性肾脏疾病(Chronic kidney disease,CKD)是一组以肾小球滤过率下降为特征的肾脏疾病,环境污染物是其危险因素之一。双酚A(Bisphenol-A,BPA)是一种常见的环境污染物,有报道称循环中BPA浓度与尿白蛋白、肾功能受损的程度呈正相关,然而其病理机制至今尚未完全阐明。中性粒细胞胞外网络(Neutrophil Extracellular Traps,NETs)是机体天然的防疫屏障,已有研究报道其过度生成或清除异常与多种肾脏损伤相关。本研究旨在探讨NETs在BPA诱导的慢性肾脏损伤中的作用及其可能的机制。方法在动物实验中,分别用5、50、500ug/kg/天浓度的BPA对C57小鼠进行为期8周的干预后收集血清及肾脏组织,通过UACR及BUN检测肾功能,PAS及Sirius Red染色观察肾脏组织损伤的情况,检测NETs相关标志物如dsDNA、MPO、citH3观察NETs在循环及肾脏组织中的表达情况。随后在500ug/kg/天浓度BPA干预的基础上,用200U DNase一周两次小鼠进行尾静脉注射降解体内中的NETs,重复上述实验观察肾脏损伤是否缓解。在细胞实验中,提取健康志愿者外周静脉血中性粒细胞,用BPA进行干预,鉴定并提取产生的NETs,通过MTT筛选合适的浓度,用于干预足细胞,通过免疫荧光、Western blot等方法检测其标志蛋白podocin和nephrin的表达以及其骨架蛋白是否存在损伤,复合DNase预处理后重复上述实验,观察DNase降解NETs后是否改善足细胞损伤。结果BPA暴露会导致小鼠肾功能受损,表现为血清肌酐、尿素氮以及尿白蛋白升高;肾脏形态学显示肾小球系膜基质扩张和肾脏纤维化程度增加;电镜下肾小球滤过屏障结构遭到破坏。同时,BPA的干预使体内血清中的dsDNA浓度增加,肾脏中NETs相关蛋白MPO和citH3沉积增多。在复合DNase干预后,发现BPA暴露诱导的肾脏损伤有明显的改善,表现为尿蛋白降低,肾小球硬化及肾脏的纤维化程度降低,肾小球滤过屏障结构恢复正常。在细胞实验中,BPA和(或)NETs的干预会导致足细胞的损伤,通过免疫组织化学以及Western blot方法检测发现足细胞标志蛋白podocin以及nephrin表达减少,同时足细胞微丝蛋白F-actin的减少,提示细胞骨架结构的紊乱。在DNase预处理后,足细胞标志蛋白表达明显恢复,细胞结构未见明显紊乱。结论NETs参与了BPA诱导足细胞及肾脏损伤,可能是慢性肾脏疾病发病的重要原因之一。