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背景与目的子宫内膜癌(Endometrial cancer,EC)是全球范围内女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,其发病率仅次于子宫颈癌居于第二位,且呈逐年上升趋势。在中国,仅2012年就有62000个新发病例,居于女性恶性肿瘤的第九位。但其发病机制尚不清楚。胰岛素样生长因子结合蛋白7(Insulin-like growth factor binging protein 7,IGFBP7)是分子量为30-k Da的一种分泌蛋白,研究发现,其在前列腺癌、恶性黑色素瘤、结直肠癌、甲状腺癌等多种实体肿瘤中表达下降或缺失,其异常表达与Cp G岛高甲基化导致基因沉默相关,应用甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2’脱氧胞苷(5-aza-2 deoxycytidine,5-Aza-d C,decitabine)处理后其表达上调,并发挥抑癌功能。课题组前期研究结果显示,IGFBP7在子宫内膜癌细胞系中表达下降或缺失,通过脂质体转染法,使子宫内膜癌细胞系中IGFBP7的表达上调,结果发现子宫内膜癌细胞的增殖速率降低,凋亡率增加;另外,向子宫内膜癌细胞培养基中加入人重组IGFBP7,发现其能通过调控MEK/ERK信号通路,抑制子宫内膜癌细胞的增殖。本实验应用5-氮杂-2’脱氧胞苷处理子宫内膜癌HEC-1A及Ishikawa细胞,观察其对子宫内膜癌细胞的增殖及对IGFBP7表达的影响,探讨其治疗子宫内膜癌的可能性。方法(1)四种不同浓度5-Aza-d C(2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)分别刺激子宫内膜癌HEC-1A及Ishikawa细胞24、48、72h。应用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测不同浓度5-Aza-d C在不同时间点对子宫内膜HEC-1A及Ishikawa细胞增殖活性的影响,并计算其对两种肿瘤细胞的抑制率。(2)应用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测5μmol/L 5-Aza-d C处理72小时前后HEC-1A及Ishikawa细胞中IGFBP7 m RNA的表达变化。(3)应用免疫蛋白印迹(Western blot)法检测5μmol/L 5-Aza-d C处理72小时前后HEC-1A及Ishikawa细胞中IGFBP7蛋白的表达变化。(4)应用统计软件SPSS17.0对实验数据进行统计学分析,定量资料以sx±表示,符合正态分布的两组独立数据间比较采用t检验,符合正态分布的多组定量资料采用单因素方差分析,多个样本均数间的两两比较采用LSD-t法,以α=0.05为检验水准结果1 CCK-8法检测不同浓度5-Aza-d C对子宫内膜癌HEC-1A及Ishikawa细胞增殖活性的影响结果显示,四种不同浓度5-Aza-d C(2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)作用24、48、72h均能抑制HEC-1A及Ishikawa细胞的增殖。相同的药物浓度,随着作用时间的延长,细胞增殖率明显降低,抑制率增加,呈时间依赖性,差异具有统计学意义(P<0.05);相同的作用时间,随着药物浓度的升高,细胞增殖率明显降低,抑制率增加,呈剂量依赖性,差异具有统计学意义(P<0.05)。2 5-Aza-d C对子宫内膜癌细胞HEC-1A及Ishikawa中IGFBP7 m RNA表达的影响结果显示,应用5μmol/L 5-Aza-d C处理HEC-1A细胞72小时后,IGFBP7m RNA的相对表达量为19.81±0.80,与处理前相比较,m RNA的表达量明显上调,差异有统计学意义(P<0.05)。5μmol/L 5-Aza-d C处理Ishikawa细胞72h后,其IGFBP7m RNA的表达量为9.39±0.94,与处理前相比较,表达明显上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。3 5-Aza-d C对子宫内膜癌细胞HEC-1A及Ishikawa中IGFBP7蛋白表达的影响结果显示,经5μmol/L 5-Aza-d C处理72小时后,HEC-1A细胞中IGFBP7蛋白的相对表达量为1.64±0.02,与处理前0.74±0.13相比,其表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。相同条件处理Ishikawa细胞后,IGFBP7蛋白的相对表达量为0.92±0.15,与处理前0.57±0.01相比,其表达水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1.5-Aza-d C对子宫内膜癌HEC-1A及Ishikawa细胞具有增殖抑制作用;2.IGFBP7在子宫内膜癌HEC-1A及Ishikawa细胞中低表达,5-Aza-d C可诱导体外子宫内膜癌细胞系IGFBP7表达,甲基化机制参与了IGFBP7的表达调控。