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研究背景:异龄异体共生即连接老年鼠循环系统与年轻鼠循环系统后建立一个共有的循环系统,将年轻鼠的血液成份带入老年鼠体内。许多研究已经证实该模型可以改善老年鼠组织器官(心、脑、肌肉、骨等)微环境,恢复这些器官的再生能力,研究表明,这些老年组织器官再生能力的恢复是通过年轻鼠血清中的正性调节因子的增加、老年鼠血清中负性调节因子的减少、或者两者同时存在的情况下改变机体内环境来实现的,该模型不仅可以增加原有细胞的增殖能力,还能够恢复这些细胞中再生的关键分子通路;通过进一步研究发现了血液中的这些正性调节因子,其中,研究较多的是“年轻因子”GDF11。年龄是促进膝关节骨关节炎发生发展的重要因素之一,与年龄相关的膝关节骨关节炎关节病理改变并不单纯地是关节软骨磨损,同时还伴随关节周围肌肉骨骼系统的改变。目前,尚未清楚异龄异体共生模型是否对老年小鼠膝关节软骨及其周围组织有影响,同样,尚未有“年轻因子”GDF11对软骨组织代谢影响的相关报道,是否有更多的“年轻因子”也值得我们进一步探究。目的:本研究旨在观察异龄异体共生模型对小鼠膝关节软骨代谢的影响,验证GDF11对小鼠膝关节软骨组织及其周围组织退变的影响,然后,留取异龄异体共生模型小鼠血清标本进行差异蛋白组学研究,以期发现更多的“年轻因子”。方法:1.观察异龄异体共生模型对小鼠膝关节软骨代谢的影响:建立异龄异体共生模型(连体2月龄与12月龄C57B/L6小鼠)10对为实验组,建立同龄异体共生模型(连体12月龄与12月龄C57B/L6小鼠)5对为手术对照组,单个12月龄C57B/L6小鼠10只为年龄对照组,连体2周时验证连体成功,连体16周后进行老年鼠的膝关节影像学检测,观察老年鼠的膝关节软骨形态学改变(番红固绿染色)以及检测与软骨退变相关指标如Col2、Col10、MMP13、Sox9及Runx2等,EdU标记检测软骨细胞增殖情况。2.通过体内外实验观察GDF11对软骨代谢影响:(1)体外实验:提取人工膝关节置换术后膝关节软骨细胞,实验组:给予含有外源性重组GDF11蛋白的培养液,对照组:培养液;结晶紫染色观察两组人软骨细胞大体形态;细胞划痕实验观察人软骨细胞迁徙能力;Western blot检测两组软骨细胞pSmade2、p Smade3、Col2、Col10、MMP13的蛋白表达情况;qRT-PCR检测相应指标的基因表达情况;EdU检测两组人软骨细胞增殖情况。(2)体内实验:实验组:12月龄C57B/L6小鼠10只,给予外源性重组GDF11蛋白(腹腔注射),0.1mg/kg/日,连续给予16周;对照组:12月龄C57B/L6小鼠10只,给予生理盐水(腹腔注射),0.1mg/kg/日,连续给予16周。16周后进行小鼠膝关节影像学检测,观察老年鼠的膝关节软骨形态学改变(番红固绿染色)免疫组化检测两组软骨pSmade2、pSmade3、Col2、Col10、MMP13的蛋白表达情况;qRT-PCR检测相应指标的基因表达情况;EdU检测两组人软骨细胞增殖情况。3.筛选差异蛋白:实验组:建立异龄异体共生模型(连体2月龄与12月龄C57B/L6小鼠)10对为实验组,建立同龄异体共生模型(连体12月龄与12月龄C57B/L6小鼠)10对为对照组,连体16周后,留取模型中老年小鼠血清进行IBT蛋白组学研究。结果:1.成功建立异龄异体共生模型,X线检查示实验组老年鼠膝关节骨赘形成、骨质硬化程度较手术对照组和年龄对照组明显改善;番红固绿染色示实验组老年鼠膝关节OARSI评分及PG丢失评分低于手术对照组和年龄对照组(P<0.05);免疫组化检测结果示实验组软骨组织Col2和Sox9蛋白含量高于对照组(P<0.05),Col10、MMP13和Runx2含量低于对照组(P<0.05);RT-PCR检测结果与免疫组化检测结果一致;实验组软骨组织中软骨细胞EdU标记的阳性细胞明显多于手术对照组和年龄对照组(P<0.05)。2.GDF11对软骨代谢影响:(1)体外实验研究结果示:Western blot检测结果示实验组软骨细胞pSmade2、pSmade3及Col2蛋白含量高于对照组(P<0.05),Col10、MMP13的蛋白表达量低于对照组(P<0.05);RT-PCR检测基因表达结果与蛋白表达结果相一致;EdU标记检测结果示实验组阳性细胞率高于对照组(P<0.05)。(2)体内实验研究结果示:X线检查示实验组小鼠膝关节骨赘形成、骨质硬化程度较对照组改善明显;番红固绿染色示实验组小鼠膝关节OARSI评分及PG丢失评分低于手术对照组和年龄对照组(P<0.05);免疫荧光及免疫组化检测结果示实验组软骨细胞pSmade2/3及Col2蛋白含量高于对照组(P<0.05),Col10、MMP13的蛋白表达量与对照组比较,差异不明显(P>0.05);RT-PCR检测基因表达结果与蛋白表达结果相一致;EdU标记检测结果示实验组阳性细胞率高于对照组(P<0.05)。3.IBT蛋白组学研究结果:显着差异蛋白共有379个,其中,上调蛋白285个,下调蛋白94个,与软骨代谢相关联的“年轻因子”有ROCK-1、TSP-1和RUVB1等体液因子。结论:1.异龄异体共生模型可延缓老年小鼠膝关节软骨退变。2.GDF11可通过磷酸化Smad2/3促进软骨细胞增殖,延缓老年膝关节软骨组织退变。3.异龄异体共生模型老年小鼠体液中存在更多的“年轻因子”。