柚皮素（naringenin）是一类存在于橘子皮等植物组织中的重要天然产物,具有众多重要的生理功能,在食品、药品和化妆品等领域均有重要应用。此外,柚皮素是一种黄酮骨架物质,可经过不同催化反应形成种类众多的具有更高附加值的黄酮类化合物。目前柚皮素的生产方式是以从橘子皮中萃取为主,这导致其价格昂贵,且无法满足市场需求。本文利用静态调控、动态调控和定向进化相结合的手段,针对柚皮素异源合成途径、脂肪酸代谢途径和乙酰-CoA来源途径进行系统优化,建立了多基因代谢途径高通量静态调控方法、不同规模的高通量筛选方法和双动态调控系统,并提出了多系统定向进化理论,实现了柚皮素合成途径的再平衡和双动态调控系统偶联发酵。研究结果为其他类似的多基因代谢途径目标产物合成提供理论与技术参考。主要研究结果如下:（1）梯度强度大肠杆菌启动子-5’UTR复合体筛选与改造。多基因代谢途径调控需要大量不同强度的启动子。基于转录组测序、RegulonDB数据库分析、mRNA和蛋白质表达水平定量分析,筛选出了104种梯度强度启动子-5’UTR复合体（PUTR）。相比较于10mM阿拉伯糖诱导的PUTR_BAD(P_BAD启动子-5’UTR复合体),所筛选PUTR转录水平和翻译水平跨度分别为0.007%-4630%和0.1%-137%。为获得更高强度PUTR,通过组合不同强度的启动子区域和5’UTR区域构建得到了一系列组合PUTR,通过直接串联不同转录和翻译强度的PUTR构建得到了一系列串联PUTR。其中两个组合PUTR(P_ssrA-UTR_rpsT和P_dnaKJ-UTR_rpsT)和两个串联PUTR(PUTR_ssrA-PUTR_infC-rplT和PUTR_alsRBACE-PUTR_infC-rplT)具有最高表达强度,蛋白质表达水平分别为PUTR_BAD的170%、137%、409%和203%。（2）柚皮素高产菌株的高通量筛选方法建立。代谢工程改造与定向进化策略相结合通常可以更好更快的实现目标。然而,依赖高效液相色谱（HPLC）的柚皮素检测方法无法实现高通量检测。基于金属离子与黄酮类化合物反应原理,通过对不同金属离子与柚皮素反应的优化和比较,建立了基于AlCl₃和Mg（Ac）₂与柚皮素反应的多孔板规模紫外光谱（373 nm）和荧光光谱（382 nm/505 nm和371 nm/492 nm）高通量检测方法。此外,以柚皮素响应蛋白TtgR为基础,建立了基于流式细胞仪的高通量筛选方法,利用远红色荧光蛋白标准化细胞体积和质粒拷贝数,最终柚皮素菌株的筛选通量可涵盖10³-10⁷/d范围,适用于绝大多数规模代谢工程改造菌株的快速筛选。（3）迭代高通量代谢流平衡策略优化柚皮素合成途径。多基因代谢途径的优化始终面临的挑战是难以同时对每一个基因进行多个水平的优化。为解决这一挑战,利用一系列所筛选的梯度强度PUTR建立不同表达规模的PUTR文库,并随机引入柚皮素合成途径基因上游,建立了多基因代谢途径随机优化文库。所有文库构建效率均高于83%,PUTR在文库中的重现率均高于60%。利用基于多孔板的高通量筛选方法,经过多轮迭代筛选和PUTR文库优化,最终获得柚皮素高产菌株,产量达192 mg·L^-1,对香豆酸积累量为29 mg·L^-1。在此基础上,进一步发现查尔酮合酶是柚皮素合成的限速步骤。（4）双动态调控系统强化丙二酰-CoA合成。已有大量报道表明丙二酰-CoA供给不足是柚皮素低产的重要原因。利用柚皮素和对香豆酸响应蛋白FdeR和PadR分别建立了针对丙二酰-CoA去路和来源代谢途径的动态调控系统,初步实现了菌体生长、柚皮素合成和对香豆酸的积累之间的平衡。为进一步协调细胞生长与产物合成之间的关系,分别优化了脂肪酸合成途径和丙二酰-CoA来源代谢途径,丙二酰-CoA产量提高7.4倍。经过优化后的丙二酰-CoA去路和来源动态调控系统分别将柚皮素产量提高3.2倍和1.5倍。与无动态调控系统相比,组合双动态调控系统菌株柚皮素产量提高3.8倍,达到139mg·L^-1。（5）定向进化策略优化偶联丙二酰-CoA来源和去路双动态调控系统。人工构建的多个调控系统在同一微生物体系中的表达往往无法相互协调。为偶联丙二酰-CoA来源和去路的双动态调控系统,利用定向进化策略分别优化FdeR和PadR蛋白的表达,以实现双动态调控系统对于柚皮素和对香豆酸的响应强度调节,达到相互偶联的目的。经过易错PCR和流式细胞仪规模的高通量筛选,柚皮素产量达到251 mg·L^-1,较未定向进化的菌株提高了1.8倍。随后进行了发酵温度、初始pH、碳源和氮源等因素的优化,最终微型反应器和摇瓶补料分批发酵优化后柚皮素的产量达到282 mg·L^-1。