水蛭素(Hirudin)是存在于医用水蛭(Hirudo medicinalis)唾液腺中的低分子量蛋白质,是凝血酶的特异性抑制剂。水蛭素对凝血酶有很高的亲和力，它与凝血酶形成摩尔比为1:1的非共价结合的可逆复合物，是一种很好的防治血栓的药物。用它作为防治血栓的药物有诸多优点：专一性强，直接特异性抑制凝血酶活性，不良反应少而轻；分子量小，几乎没有抗原性；小分子蛋白质，几乎没有毒性；抗栓作用稳定、持久。　　同时水蛭素也存在一些问题，极大地影响了水蛭素的临床应用：①水蛭素抗凝血的同时也延长了出血时间，过量容易引起非溶栓部位出血；②对水蛭素所致出血没有良好的对抗药物；③水蛭素只具有抗凝血酶活性，能有效地防治静脉血栓，而不能防治动脉血栓。　　因此为了减少天然水蛭素出血的副作用和增加其防治动脉血栓的活性，本课题基于对天然水蛭素构效关系的深入研究，在保留天然水蛭素原有活性的基础上，将FXa识别序列融合到水蛭素N端以增强水蛭素的靶向性而减少出血副作用；将Arg-Gly-Asp(RGD)三肽序列融合在水蛭素的合理部位以增强抗血小板聚集作用而增加其防治动脉血栓的活性。同时，在目的蛋白N端增加一个9×His Tag以便于蛋白的分离纯化,以期为大量生产靶向双功能水蛭素提供有效的基因工程手段。　　本课题根据设计的融合蛋白氨基酸序列和毕赤酵母的密码子偏好性，设计了六条引物经三轮PCR获得目的基因。将目的基因与毕赤酵母载体pPIC9K质粒重组构建表达质粒，电转化毕赤酵母 GS115宿主菌，经 G418筛选得到高表达的阳性克隆，鉴定为甲醇利用快型(Mut+)，在摇瓶中实现融合蛋白的高效、稳定和分泌性表达。培养液上清经超滤离心、亲和层析纯化到单一的目的蛋白，经蛋白酶切和Western bloting验证，并通过凝血酶滴定法测定目的蛋白抗凝血酶比活性和天然水蛭素几乎没有差别。为进一步优化表达条件、分析目的蛋白的功能奠定了基础。