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研究背景乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是一种嗜肝DNA病毒,目前全世界约有3.5亿HBV感染者。HBV感染可形成乙型肝炎、肝硬化(liver cirrhosis,LC)、肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)等一系列疾病,统称为HBV感染相关性肝病。HBV感染相关性肝病具有发病率高、病程长、预后差等特点,严重威胁着人类健康。既往普遍认为HBV持续复制,导致肝细胞破坏、肝功能损伤是导致HBV感染相关性肝病的病理基础,因此抗病毒治疗一直是HBV感染相关性肝病的治疗焦点。虽然抗病毒治疗在HBV感染相关性肝病的治疗中占有主导地位,但是,抗病毒治疗仍然存在许多局限性和缺点。一方面,抗病毒治疗过程中出现的病毒变异、耐药等一系列副作用严重影响了药物的疗效,另一方面,抗病毒治疗并没有完全阻断HBV感染相关性肝病的发展进程。因此,探索HBV感染相关性肝病的新的发病机制,以控制其病程发展,寻找更好的治疗方案已经成为当前研究的新方向。口前研究表明,HBV感染相关性肝病的发病机制并非仅有HBV单因素参与,而是乙型肝炎病毒感染后继发机体细胞免疫反应和HBV双重因素共同作用的结果,其中T淋巴细胞在HBV持续感染免疫反应过程中起了核心作用。因此,探讨T细胞介导的免疫损伤在HBV感染相关性肝病中的发病机理显得尤为重要。调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)与辅助性T细胞 17(T helper cell 17,Th17)起源于共同初始T细胞,二者之间关系密切而又复杂。尽管它们表面的大部分趋化受体是相同的,但是两者在功能上表现为相互对抗。Treg细胞可以分泌免疫抑制因子,抑制免疫反应;反之,Th17细胞可以分泌促炎因子,增强免疫应答。在正常情况下,Treg细胞与Th17细胞保持动态平衡,导致机体产生适当强度的免疫应答,有利于机体免疫稳定状态的维持。Treg/Th17失衡将会产生异常免疫应答,最终导致免疫性疾病、肿瘤性疾病、以及感染性疾病等多种疾病的发生。最新观点认为,Treg/Th17失衡可能参与了HBV感染相关性肝疯的发病机制。目前研究已经证实,慢性乙型肝炎存在Treg/Th17失衡。Treg及其相关细胞因子,可以抑制过度免疫应答,减轻肝脏炎症损伤,但同时使得机体的病毒清除能力下降,进而导致HBV感染的慢性化;Th17能够趋化炎性细胞在肝脏中聚集,在加重炎症损伤的同时,参与机体的抗感染免疫,具有一定抗病毒效果,Treg/Th17失衡在慢性乙型肝炎发病机制中起了重要作用。然而,目前仍缺乏对乙型肝炎肝硬化、HBV相关性肝癌患者体内Treg、Th17细胞作用的系统研究。在乙型肝炎肝硬化、HBV相关性肝癌进展过程中,Treg与Th17细胞表达水平如何变化?是否存在Treg/Th17失衡?如果存在Treg/Th17失衡,那么Treg/Th 17失衡对乙型肝炎肝硬化及HBV相关性肝癌发病机制有着何种影响?以上都是本课题研究的目的。第一部分Treg/Th17失衡在乙型肝炎肝硬化患者中的改变及临床价值研究目的:1.确定乙型肝炎肝硬化患者中是否存在Treg/Th17失衡。2.确定Treg、Th17、Treg/Th17比值与乙型肝炎肝硬化临床分期的关系。3.确定乙型肝炎肝硬化Treg与Th17细胞表达是否存在相关性。研究方法:选取2016.01-2016.07于山东大学齐鲁医院肝病科就诊的未曾接受任何治疗的93例乙型肝炎肝硬化病人作为LC组,根据Child-Pugh分级标准,其中45例为代偿期肝硬化(compensated liver cirrhosis,CLC)组,48例为失代偿期肝硬化(decompensated liver cirrhosis,DCLC)组,40例来自山东大学齐鲁医院查体中心的健康体检者作为对照(Control,Ctrl)组。收集研究对象外周静脉血,利用流式细胞术分析的方法测定Treg、Th 17细胞比例。结果:1.与Ctrl组相比,LC组CD4+CD25+FOXP3+ Treg细胞比例明显减少(P<0.01),CD4+IL-17+Th17细胞比例明显增加(P<0.001),Treg/Th17比值明显降低(P<0.001)。2.与Ctrl组相比,CLC组CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞比例明显减少(P<0.01),DCLC组CD4+CD25+FOXP3+ Treg细胞比例明显减少(P<0.001),并且DCLC组CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞比例较CLC组明显减少(P<0.001);与Ctrl组相比,CLC 组 CD4+IL-17+ Th 17 细胞比例明显增加(P<0.001),DCLC 组 CD4+IL-17+ Th 17细胞比例明显增加(P<0.001),并且DCLC组CD4+IL-17+ Th17细胞比例较CLC组明显增加(P<0.001);与Ctrl组相比,CLC组Treg/Th17比值明显降低(P<0.001),DCLC组Treg/Th17比值明显降低(P<0.001),并且DCLC组Treg/Th17比值较CLC组明显降低(P<0.001)。3.Spearman 相关分析显示,LC 组 Treg 与 Th17 呈负相关(r=-0.6386,P<0.0001)。结论:乙型肝炎肝硬化患者存在Treg/Th17失衡,表现为Treg明显降低,Th17明显升高,Treg/Th17比值明显降低,Treg与Th17呈负相关,Treg、Th17、Treg/Th17比值均与乙型肝炎肝硬化临床分期有着密切关系,提示Treg/Th17失衡不仅参与了乙型肝炎肝硬化的发病机制,而且与乙型肝炎肝硬化病情进展、预后密切相关,对Treg/Th17失衡与乙型肝炎肝硬化关系的深入研究或许可以为乙型肝炎肝硬化提供新的治疗靶点。第二部分Treg/Th17失衡在HBV相关性肝癌患者中的改变及临床价值研究目的:1.确定HBV相关性肝癌患者中是否存在Treg/Th 17失衡。2.确定Treg、Th17、Treg/Th17比值与HBV相关性肝癌临床分期、肿瘤直径的关系。3.确定HBV相关性肝癌Treg与Th17细胞表达是否存在相关性。研究方法:选取2013.05-2016.03期间于山东大学齐鲁医院肝病科就诊的未曾接受任何治疗的51例HBV相关性肝癌患者作为HCC组,将病人按TNM分期、肿瘤直径分组,其中35例为HCC早期(stage Ⅰ-Ⅱ)组,16例为HCC晚期(stage Ⅲ-Ⅳ)组;35例为直径较小肝癌(size<5cm)组,16例为直径较大肝癌(size≥5cm)组,42例来自山东大学齐鲁医院查体中心的健康体检者作为Control组。收集研究对象外周静脉血,利用流式细胞术分析的方法测定Treg、Th17细胞比例。结果:1.与Control组相比,HCC组CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞比例明显升高(P<0.001),CD4+IL-17+Th17细胞比例明显升高(P<0.001),Treg/Th17比值明显升高(P<0.001)。2.与Control组相比,不同肿瘤分期HCC组CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞比例均升高(P<0.001),且 stage Ⅲ-Ⅳ 组 CD4+CD25+FOXP3+Treg 细胞比例较 stageⅠ-Ⅱ组明显升高(P<0.001)。与Control组相比,不同肿瘤分期HCC组CD4+IL-17+Th17 细胞比例均升高(P<0.001),且 stage Ⅲ-Ⅳ 组 CD4+IL-17+Th17细胞比例较stage Ⅰ-Ⅱ组明显升高(P<0.001)。与Control组相比,不同肿瘤分期 HCC 组 Treg/Th17 比值均升高(P<0.001),但 stage Ⅲ-Ⅳ组 Treg/Th17比值与stage Ⅰ-Ⅱ组相比无明显差异性(P>0.05)。3.与Control组相比,肿瘤早期患者中不同肿瘤直径组CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞比例均升高(P<0.001),且 size≥5cm 组 CD4+CD25+FOXP3+Treg 较 size<5cm组明显升高(P<0.001)。与Control组相比,肿瘤早期患者中不同肿瘤直径组CD4+IL-17+Th17 比例均升高(P<0.0]),且 size≥5cm 组 CD4+IL-17+Th17 较size<5cm组明显升高(P<0.05)。与Control组相比,肿瘤早期患者中不同肿瘤直径组Treg/Th17 比值均升高(P<0.05),但size≥5cm 组 Treg/Th17 比值较size<5cm组相比无明显差异性(P>0.05)。与Control组相比,肿瘤晚期患者中不同肿瘤直径组CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞比例均升高(P<0.001),且 size≥5cm 组 CD4+CD25+FOXP3+Treg 较 size<5cm组明显升高(P<0.01)。与Control组相比,肿瘤晚期患者中不同肿瘤直径组CD4+IL-17+Th17 比例均升高(P<0.05),且 size≥5cm 组 CD4+IL-17+Th17 较size<5cm组明显升高(P<0.05)。与Control组相比,肿瘤晚期患者中不同肿瘤直径组Treg/Th17比值均升高(P<0.001),但size≥5cm组Treg/Th17比值较size<5cm组相比无明显差异性(P>0.05)。与Control组相比,HCC组不同肿瘤直径患者CD4+CD25+FOXP3+ Treg细胞比例均升高(P<0.001),且 size≥5cm 组 CD4+CD25+FOXP3+Treg 较 size<5cm 组明显升高(P<0.001)。与Control组相比,HCC组不同肿瘤直径患者CD4+IL-17+Th17 比例均升高(P<0.001),且 size≥5cm 组 CD4+IL-17+ Th17 较 size<5cm 组明显升高(P<0.001)。与Control组相比,HCC组不同肿瘤直径患者Treg/Th17比值均升高(P<0.01),但size≥5cm组Treg/Th17比值较size<5cm组相比无明显差异性(P>0.05)。4.Spearman 相关分析显示,HCC 组 Treg 与 Th17 呈正相关(r=0.4895,P<0.001)。结论:HBV相关性肝癌患者存在Treg/Th17失衡,表现为Treg、Th17、Treg/Th17比值均明显升高,Treg与Th 17呈正相关,二者与HBV相关性肝癌临床分期、肿瘤直径均有密切关系,提示Treg、Th17不仅参与HBV相关性肝癌发病机制,而且与其病情进展、预后密切相关,调节Treg、Th17细胞分化,纠正Treg/Th17失衡对控制HBV相关性肝癌疾病进展、改善HBV相关性肝癌患者的预后具有重要意义,深入研究Treg/Th17失衡与HBV相关性肝癌的关系或许可以为HBV相关性肝癌的免疫治疗开拓新的思路。