论文部分内容阅读
桔小实蝇Bactrocera dorsalis（Hendel）隶属于双翅目（Diptera）、实蝇科（Tephritidae）、果实蝇属（Bactrocera）,又称东方果实蝇。桔小实蝇寄主范围广,繁殖速度快,适应性强,危害性大。目前对桔小实蝇的防治以化学药剂防治为主,然而化学药剂的不合理使用,不仅对环境造成严重的污染,而且使桔小实蝇抗药性不断增强,防控难度进一步提升。近年发展起来的引诱剂对桔小实蝇的防治效果较好,但由于桔小实蝇的嗅觉机制尚不明确,故在实际生产中仍存诸多因素限制引诱剂的进一步推广。因此,探明桔小实蝇对信息化合物反应的分子机制可为该虫的防控提供新的思路和途径。昆虫气味结合蛋白（Odorant Binding Proteins,OBPs）在信息化合物的识别和转运过程中具有十分重要的作用,是昆虫感受环境中寄主挥发物的重要蛋白。据此,本学位论文在筛选鉴定和克隆BdorOBP50c cDNA序列的基础上,通过解析该基因的时空表达模式以及运用RNAi、EAG及行为学分析技术探索该基因的功能,旨在为桔小实蝇的防控提供新靶标和新思路。主要研究结果如下:1桔小实蝇BdorOBP50c的cDNA序列克隆及系统发育分析采用PCR技术,克隆获得桔小实蝇BdorOBP50c的cDNA序列,开放阅读框全长一共753 bp,编码251个氨基酸;N端具有由18个氨基酸组成的信号肽,成熟肽分子量为26.9 KD,理论等电点为5.50;序列比对结果表明,桔小实蝇BdorOBP50c隶属plus-C OBP家族,有8个保守半胱氨酸残基,但缺少最末位的保守半胱氨酸残基。采用邻接法进行系统发育分析,结果显示,根据保守半胱氨酸的数量,聚类为3支,桔小实蝇BdorOBP50c与柑桔大实蝇BminOBP50c同源性最高,相似度达70.38%,与黑腹果蝇DemlOBP50e氨基酸序列相似度较低,仅为5.41%。2桔小实蝇BdorOBP50c的时空表达模式利用RT-qPCR技术,检测了BdorOBP50c在桔小实蝇成虫不同日龄及组织中的表达量。结果显示,桔小实蝇BdorOBP50c在不同日龄的雌虫中表达量相对稳定,不同日龄间的基因表达量无显著差异;桔小实蝇BdorOBP50c在雄虫9日龄的表达量显著高于其它日龄;桔小实蝇BdorOBP50c的表达量在5日龄和9日龄雌雄间存在显著差异,暗示该基因在雌雄之间存在不同的功能。对不同组织定量结果显示桔小实蝇BdorOBP50c在头、胸、腹的表皮组织中以及下颚须、触角、足和翅均有少量表达,但相互之间没有显著差异。BdorOBP50c在脂肪体中表达量显著高于其他组织,推测该基因与脂肪体相关生理功能有关。3桔小实蝇BdorOBP50c对环境胁迫的响应桔小实蝇经低温处理后,BdorOBP50c表达量与对照组相比未发生显著变化;但在高温处理后,该基因的表达量显著降低,分别是对照表达量的22.29%、18.53%和25.41%;以马拉硫磷LC50的浓度处理后,BdorOBP50c在脂肪体中的表达量显著下调;桔小实蝇经饥饿处理后,BdorOBP50c的表达量亦下调,且随着饥饿时间的延长,表达量下调幅度加大,但在恢复食物供给后,该基因的表达量又恢复到处理前水平。4桔小实蝇BdorOBP50c功能初探采用注射dsBdorOBP50c的方法干扰BdorOBP50c的表达,结果显示RNAi对桔小实蝇雌、雄成虫均有效,沉默效率较为稳定,均达80%以上;桔小实蝇RNA i处理的雌虫与对照GFP处理的雌虫对所检测气味化合物的EAG反应无显著差异,但RNA i处理的雄虫与对照雄虫相比对惕各酸乙酯的EAG反应明显降低,且对苯丙噻唑的反应也有降低的趋势,而对γ-辛内酯和（+）,二戊烯的EAG反而有增强的趋势。进一步采用引诱装置进行行为学分析,结果显示,RNAi处理的试虫对惕各酸乙酯的行为趋性与对照相比无显著差异。药剂敏感性试验结果表明干扰后试虫对马拉硫磷的敏感性未发生显著变化。