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干旱、高盐和低温是影响植物生长、发育和限制作物产量提高的主要非生物胁迫因素。近年来,研究发现植物应答非生物胁迫与微管的动态变化有着密切的联系。微管的这种动态变化需要微管结合蛋白(microtubule-associated proteins,MAPs)的精确调控,MAP65就是其中一种非常重要的微管结合蛋白。 运用RT-PCR技术在玉米幼苗叶片中克隆出1个玉米微管结合蛋白ZmMAP65-1a。进化树分析表明,ZmMAP65-1a与水稻MAP65-1高度同源,编码产物为584个氨基酸,分子量为65.18kD,等电点为4.845。结构分析表明ZmMAP65-1a微管结合区MTB2存在着磷酸化位点,亚细胞定位实验表明ZmMAP65-1a可能定位在微管上。 首先利用玉米原生质体瞬时表达和瞬时沉默体系研究表明ZmMAP65-1a参与了BR诱导的抗氧化防护。瞬时表达mMAP65-1a能显著提高抗氧化防护酶SOD和APX的基因表达和酶活性,而瞬时沉默mMAP65-1a则出现相反的结果。进一步利用原生质体瞬时沉默体系研究表明,ZmMAP65-1a通过调节NADPH氧化酶基因ZmrbohA-D的表达参与了BR诱导的玉米原生质体中H2O2的产生。其次利用双分子荧光互补实验(BiFC)体内证明了ZmMAP65-1a与ZmMPK5互作,体外磷酸化实验表明ZmMPK5直接磷酸化ZmMAP65-1a。并且进一步证明了ZmMAP65-1a与ZmMPK5在BR诱导的抗氧化防护中存在相关性,这些结果表明ZmMPK5参与BR诱导的抗氧化防护的一条途径是通过磷酸化ZmMAP65-1a完成的。 已有证据显示,BR处理可以诱导玉米叶片ABA的积累。利用原生质体瞬时表达和瞬时沉默体系研究表明ZmMAP65-1a参与了ABA诱导的抗氧化防护。ABA合成抑制剂实验表明ABA参与了BR对ZmMAP65-1a、ZmrbohA-D基因表达和ZmMPK5激酶活性的上调作用。这些结果表明ZmMAP65-1a与ZmMPK5参与BR诱导的抗氧化防护是通过BR诱导ABA产生进而将信号传递下去。 NAC转录因子是一类植物特有的转录因子,它的命名来源于牵牛花NAM、拟南芥ATAF1/2和CUC2基因的首个字母。作为一类庞大的基因家族,NAC转录因子参与了植物的很多生理进程包括发育、衰老、次生壁建成、应答生物和非生物胁迫。本实验利用玉米原生质体瞬时表达、瞬时沉默和显性嵌合抑制沉默体系分析ZmNAC在ABA依赖的胁迫信号途径中的作用,并进一步研究其与ZmCCaMK互作在抗氧化防护中的作用,同时构建了过表达ZmNAC的转基因烟草初步探索了其在逆境胁迫中的初步功能。 运用生物信息学详细分析ZmNAC的结构特性,Zm NAC编码431个氨基酸,分子量为47.94kD,等电点为7.74,具有一个保守的N端NAM结构域,位于43aa-204aa。亚细胞定位显示其位于细胞核,酵母转录激活实验表明其具有转录激活活性,且C端为其转录激活区。凝胶迁移实验(EMSA)表明ZmNAC可以与玉米ZmERD1基因启动子的顺式作用元件CATGTG结合。荧光定量PCR实验结果显示ZmNAC在玉米各种组织中组成型表达,与其他组织相比在雌花中表达量最高,并且响应各种非生物胁迫和外源激素处理。 首先利用玉米原生质体瞬时表达、瞬时沉默和显性嵌合抑制沉默体系研究表明ZmNAC参与ABA诱导的抗氧化防护。进一步研究发现ZmNAC通过调节玉米NADPH氧化酶基因ZmrbohA-D的基因表达参与调节ABA诱导的H2O2的产生。ABA合成抑制剂实验表明ZmNAC响应NaCl、PEG的胁迫信号依赖于或部分依赖于ABA。利用双分子荧光互补实验(BiFC)体内证明了ZmCCaMK与ZmNAC互作,并且证明了ZmCCaMK与ZmNAC在ABA诱导的抗氧化防护中存在相关性,进一步研究发现ZmCCaMK与ZmNAC的相互作用同样影响玉米原生质体H2O2的产生。体外磷酸化实验表明ZmCCaMK可以直接磷酸化ZmNAC,并利用点突变实验找到了影响ABA诱导的SOD和APX酶活性ZmNAC可能的磷酸化位点。另外本实验构建了ZmNAC转基因载体,获得了过表达ZmNAC的转基因烟草。对ZmNAC转基因烟草进行抗逆性分析表明,与野生型相比,过表达植株对水分胁迫和盐胁迫的耐受性更强。