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Bacillus licheniformis(地衣芽胞杆菌)WX-02分离自盐矿,在盐胁迫条件下能够高产聚Y-谷氨酸等活性物质。和B.subtilB.一样,都被认为是可以表达外源蛋白的安全菌株。然而,这类芽胞杆菌表达外源蛋白往往表达量很低,限制了其作为表达系统的进一步发展。究其原因,芽胞杆菌的蛋白酶很丰富,容易降解其所表达的外源蛋白,敲除蛋白酶后有利于外源蛋白表达量的提高。本研究首先对WX-02菌株进行全基因组测序,找出其主要的胞外蛋白酶基因。提取了 B.licheniformis WX-02的基因组DNA,与华大基因公司合作,采用Illumina Hiseq2000平台测序。对测序结果分析,发现存在多个gap。通过设计引物进行PCR扩增、Sanger测序及序列拼接,最终得到WX-02完整的基因组序列,在GenBank登录号为AHIF00000000。后续基因组注释发现,该基因组中存在166个已知和假定的蛋白酶(或肽酶),其中与细胞膜和细胞壁结合的有33个,细胞内有119个,细胞外有14个。根据WX-02基因组序列和蛋白酶注释结果,本研究构建了 10个基因敲除载体。叠加敲除了野生型WX-02菌株10个与其胞外分泌表达可能有关的基因(hag,mpr,vpraprX,epr,bpr,wprA,aprE,amyL,bprA),得到了系列缺失菌株 BL1-BL10。用明胶酶谱检测BL9,结果显示有4个蛋白酶条带,约占野生型胞外蛋白酶活性的55%。BL10的明胶酶谱结果显示其完全没有胞外蛋白酶活性。根据实验结果和其他有关蛋白酶文献报道,推测BprA在分泌到胞外的过程中,能够自我剪切成较小分子量的另外三个蛋白酶。推测4个蛋白酶中,分子量最小的是成熟蛋白(约30 KDa),其酶活力在4者中最大。本研究构建了表达载体pP43SAT,用于组成型分泌表达B.licheniformis α-淀粉酶,检测经改造宿主对自身酶蛋白的分泌表达能力。BL9(pP43SAT)在产α-淀粉酶培养基中最高酶活力为94.48 U/mL,BL10(pP43SAT)的最高酶活力达到106.02 U/mL,BL10(pP43SAT)的酶活力比 BL9(pP43SAT)提高了 12.22%;BL10(pP43SAT)的单位菌体酶活力是WX-02(ΔamyL;pP43SAT)的1.13倍,后者的单位菌体酶活力和BL9(pP43SAT)相当。以上数据表明BprA蛋白酶的去除更有利于α-淀粉酶的表达,推测BprA可能会部分降解淀粉酶或者抑制其合成和分泌。本研究构建了表达载体pP43SNT,用于组成型分泌表达枯草芽胞杆菌MBS 04-6的纳豆激酶(NK),考察经改造的宿主菌株对外源蛋白分泌表达的应用效果。将用于表达外源蛋白NK的工程菌BL10(pP43SNT)在基础培养基LB中培养28h,SDS-PAGE分析和NK的纤溶酶活力测定,证实了外源蛋白NK能够在突变株中高效分泌表达。本实验验证了 vpr信号肽能高效介导外源蛋白分泌表达,且首次实现了纳豆激酶在地衣芽胞杆菌中分泌表达。测得BL10(pP43SNT)在LB培养基中培养24h时,NK纤溶酶活最高,酶活力为6.00FU/mL。经在LB培养基基础上简单优化组分后,以1%大豆蛋白胨、1%酵母粉和1%麦芽糖作为发酵培养基培养BL10(pP43SNT),32h取样,酶活力达到11.37FU/mL。利用黄豆为培养基原料,固体发酵44 h,BL10(pP43SNT)的酶活力达到433.73 FU/g(干重),高于目前文献报道的结果;BL10(pP43SNT)比野生型宿主工程菌WX-02(pP43SNT)纤溶酶活力提高了 12%。同时,在固体发酵过程中产生的y-PGA较少(BL10(pP43SNT)为6.70 g/kg),低γ-PGA产量有利于纳豆激酶的分离和纯化。