论文部分内容阅读
大肠癌是发病率和致死率较高的恶性肿瘤之一,约50-60%的大肠癌患者会出现转移。转移是大肠癌的显著特点之一,也是大肠癌致死的主要原因。肿瘤的转移过程包括血管生成、细胞粘附、侵袭、转移及增殖等,这一过程受许多极其复杂的信号通路的调控。其中,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信号通路备受关注。mTOR是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在肿瘤侵袭、迁移及转移过程中起着极其关键的作用。mTOR被认为是Akt的下游,并通过激活4E-BP1和p70S6K调控多种肿瘤相关蛋白的翻译。最近有文献表明]mTOR信号通路通过增加MMP-9(matrix metallo proteinase-9, MMP-9)的表达,促进细胞的侵袭和迁移。MMP-9是基质金属蛋白酶家族中的重要成员,主要的生理作用是降解细胞外基质(extracellular matrix, ECM),在肿瘤侵袭转移中起关键性作用。因此,抑制mTOR信号通路可作为治疗大肠癌的潜在手段。南蛇藤(Celastrus Orbiculatus Thunb.)在我国广泛分布,主要用于治疗风湿和其他炎症。我课题组前期实验发现,南蛇藤提取物(Celastrus Orbiculatus extracts, COE)可通过抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭、粘附及血管生成能力从而发挥显著的体内外抗肿瘤活性。本研究首次对COE体外抗人大肠癌HT-29细胞转移进行研究。结果证实,COE可抑制HT-29细胞增殖、侵袭及迁移能力,并呈浓度依赖性。并进一步探讨COE对mTOR信号通路相关蛋白的影响,该信号通路与大肠癌转移过程密切相关。结果表明COE能降低HT-29细胞mTOR通路相关蛋白的表达水平。综上,本研究初步表明南蛇藤提取物能体外抑制HT-29细胞转移相关过程,包括增殖,侵袭及迁移。该抑制作用可能与其下调mTOR信号通路有关。本研究为此药的进一步开发与临床应用提供有力的实验依据。本研究共分为两部分内容。第一部分南蛇藤提取物对人大肠癌细胞HT-29增殖、侵袭及迁移的影响研究目的：研究南蛇藤提取物(Celastrus Orbiculatus extracts, COE)对人大肠癌细胞HT-29增殖、侵袭、迁移的影响。研究方法：体外培养人大肠癌HT-29细胞,设COE组(浓度分别为20,40,80,160,320μg/mL)、阴性对照组和阳性对照组。采用MTT实验检测COE对HT-29细胞增殖的抑制作用；倒置显微镜观察COE对HT-29细胞形态的改变；采用Transwell侵袭实验检测COE对HT-29细胞侵袭能力的改变；采用细胞划痕实验和Transwell迁移实验检测COE对HT-29细胞迁移能力的改变。研究结果：COE能抑制HT-29细胞的增殖能力,呈明显的浓度依赖性；COE20,40,80μg/mL能显著降低HT-29细胞的侵袭和迁移能力(P<0.05或P<0.01),并呈浓度依赖性。研究结论：COE能有效抑制人大肠癌HT-29细胞增殖,并能抑制其侵袭和迁移能力。第二部分南蛇藤提取物对HT-29细胞mTOR相关信号通路蛋白表达的影响研究目的：探讨南蛇藤提取物(COE)对mTOR信号通路相关蛋白的影响,该信号通路与大肠癌转移过程密切相关。研究方法：不同浓度COE (20,40,80,160,320μg/mL)处理人大肠癌HT-29细胞24h后,提取各组的总蛋白。Western blot法检测各组细胞蛋白的表达水平。检测的蛋白包括mTOR及]mTOR信号通路上下游调控蛋白Akt, p70S6K,4E-BP1和MMP-9。研究结果：COE能降低HT-29细胞中mTOR, p-mTOR, p-4E-BP1, p-p70S6K, p70S6K和MMP-9蛋白的表达水平,并呈浓度依赖性。研究结论：COE抑制HT-29细胞的转移机制可能与其抑制mTOR信号通路有关。