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第一部分:PLCε特异性shRNA对人膀胱癌BIU-87细胞体外增殖效应的实验研究目的:探讨PLCε特异性shRNA对人膀胱癌BIU-87细胞体外增殖效应的影响。方法:通过真核细胞转染技术将pGenesil-PLCε重组质粒转染BIU-87细胞,并同时设转染pGenesil-NP重组质粒细胞和转染生理盐水细胞分别作为阴性对照组和空白对照组,G418筛选阳性克隆细胞,单克隆挑选,扩大培养,RT-PCR及Western blot法检测PLCεmRNA和蛋白表达,MTT法检测细胞增殖能力的改变,流式细胞法检测细胞的周期分布。结果:获得稳定表达PLCε-shRNA的阳性克隆BIU-87细胞,克隆细胞PLCεmRNA和蛋白表达抑制率为46.65%和35.68%,G0/G1期细胞增多,G2/M期细胞减少,细胞增殖受到明显抑制。结论:pGenesil-PLCε重组质粒可有效沉默BIU-87细胞PLCεmRNA和蛋白表达,并使细胞周期阻滞于G0/G1期,延缓细胞生长,从而抑制细胞增殖。第二部分:PLCε特异性shRNA对人膀胱癌BIU-87细胞体内增殖效应的实验研究目的:探讨PLCε特异性shRNA对人膀胱癌BIU-87细胞体内增殖效应的影响,并研究其相关机制。方法:将第一部分获得的稳定转染细胞分别接种于裸鼠皮下建立人膀胱癌裸鼠移植瘤模型,相对应的分为实验组、阴性对照组以及空白对照组,监测移植瘤体积,称移植瘤重量,免疫组织化学法检测移植瘤组织cyclinD1蛋白表达。结果:实验组裸鼠移植瘤生长缓慢,移植瘤的体积和重量都明显小于对照组(p<0.01),抑瘤率为71.95%,实验组移植瘤cyclinD1蛋白表达受到抑制。结论: PLCε基因沉默后可抑制裸鼠移植瘤的生长,PLCε的这些作用可能和下调cyclin D1蛋白的表达有关。第三部分:PLCε特异性shRNA对人膀胱癌BIU-87细胞裸鼠移植瘤中Bcl-2及Bax蛋白表达水平的影响目的:探讨应用短发夹RNA干扰技术沉默PLCε基因对人膀胱癌移植瘤生长及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。方法:人膀胱癌BIU-87细胞种植于裸鼠皮下,待移植瘤体积达40mm3左右时,在肿瘤部位分别直接注射PLCε特异性shRNA表达质粒、阴性对照质粒以及0.9%氯化钠溶液;观察肿瘤体积的变化情况,30 d后处死全部裸鼠,取瘤组织,称瘤质量;瘤组织制备病理切片,HE染色观察细胞形态的变化;RT-PCR鉴定瘤组织中PLCεmRNA的表达;Western印迹法检测瘤组织中PLCε、Bcl-2、Bax、p-Akt1/ Akt1和p-Bad/Bad蛋白的表达。结果:PLCε-shRNA组小鼠移植瘤生长明显缓慢,瘤组织体积和质量均明显小于对照组;HE染色结果显示,瘤组织中出现细胞核固缩、裂碎等凋亡征象;RT-PCR检测结果显示, PLCεmRNA表达明显降低(P<0.05);Western印迹法结果提示,PLCε和Bcl-2蛋白表达量明显降低,Bax蛋白表达明显增加,与2个对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);而Akt1、Bad蛋白的表达,在实验组以及对照组中差异均无统计学意义,p-Akt1和p-Bad在移植瘤中未见表达。结论:沉默PLCε基因可明显抑制PLCε的表达,下调Bcl-2蛋白以及上调Bax蛋白的表达,促进膀胱癌细胞凋亡而抑制肿瘤生长。