目的:乳腺癌是女性恶性肿瘤中发病率最高的肿瘤,也是女性最常见恶性肿瘤之一。有研究数据显示,全世界每年约140万女性发生乳腺癌,约46万女性死于乳腺癌。手术切除乳腺癌病灶,并辅助化疗,放疗等治疗手段使乳腺癌的疗效有了明显提高。然而在临床治疗过程中,患者在经过一定疗程的治疗后,往往对化疗药物产生耐受性,治疗效果大打折扣,因此乳腺癌患者的预后情况仍然不乐观。因此,寻求新的生物标记物和靶向治疗点,可以为提高乳腺癌患者的总体生存率提供更多的可能性。Ajuba属于LIM蛋白的Zyxin/Ajuba家族,其C端具有LIM或者pre LIM结构。大量研究显示Ajuba在宫颈癌,食管鳞细胞癌,结直肠癌,胃癌和胰腺癌等多种癌症中通过调控多种信号通路的活性,发挥促癌因子功效。Ajuba在肿瘤细胞中的调控网络非常复杂。在本课题研究中我们将探究Ajuba在乳腺癌中表达情况,临床病理意义,表达差异对乳腺细胞生物学功能,尤其是对紫杉醇化疗耐药性的产生影响以及潜在的分子生物学机制。研究方法:1、组织样本93例浸润性乳腺癌组织以及15例正常乳腺组织来自在中国医科大学附属第一医院进行乳腺癌手术的患者。2、免疫组织化学将乳腺癌组织样本石蜡包埋后制备4μm切片备用。将经脱蜡,抗原修复和封闭后的切片进行抗体孵育。本实验所用一抗为Ajuba（1:100）。使用DAB显色试剂盒显色,而后切片经过苏木素复染。评估染色情况,统计Ajuba在乳腺癌组织中的表达情况。3、细胞培养本实验所用细胞系为:人正常乳腺上皮细胞MCF-10A（购于American type culture collection）,人乳腺癌细胞系:SK-BR-3,MCF-7,MDA-MB-453,MDA-MB-468,BT474（以上五株细胞均购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）,BT549以及T47D（以上两株细胞购于武汉普诺赛生命科技有限公司）。使用含有10%胎牛血清的培养基,在37℃,5%CO2,饱和湿度条件下恒温培养。4、细胞转染和干扰Ajuba质粒以及阴性对照空载质粒购于美国傲锐东源公司,质粒转染实验使用Lipofectamine 3000试剂。干扰Ajuba si RNA,TAZ si RNA以及阴性对照non-targeting si RNA均购于美国Dharmacon公司,使用Dharma FECT进行si RNA干扰实验。收集经过转染及干扰后的细胞,进行下游细胞功能实验。5、Western blot将样本蛋白提取,定量后进行SDS-PAGE凝胶电泳,转印至PVDF膜。封闭结束后进行抗体孵育。本实验所用一抗为Ajuba（1:800）,DDK（1:800）,GLUT3（1:1000）,Survivin（1:1000）,TAZ（1:1000）以及GAPDH（1:1000）,二抗为羊抗兔Ig G-HRP（1:2000）,羊抗鼠Ig G-HRP（1:2000）。抗体结束后进行ECL化学发光。6、实时定量PCR使用Trizol进行RNA提取并使用NanoDrop 2000c测定RNA浓度。PrimeScrip RT Master Mix试剂盒进行RNA反转录,SYBR Green Master Mix进行实时定量PCR荧光采集。实时定量PCR所用仪器为ABI 7500,使用Actin为内参,基因扩增结果使用2-△△ct法进行分析。7、细胞增殖实验（1）CCK8细胞增殖实验:将3000个细胞接种于96孔板中,37℃,5%CO2,饱和湿度,恒温连续培养5天。每天使用酶标仪检测450nm吸光度值,绘制折线图,测定Ajuba表达差异对细胞增殖的影响。（2）集落形成实验:将1000个细胞接种于6cm皿中,37℃,5%CO2,饱和湿度,恒温连续培养14天。细胞固定后经Giemsa染色液染色。对集落进行计数,分析Ajuba表达差异对细胞集落形成能力的影响。8、细胞周期将实验处理后的细胞消化后重悬于预冷的75%酒精中,-20℃固定过夜。PBS漂洗细胞后,使用PI对细胞进行染色。使用流式细胞仪对细胞周期进行分析。9、Transwell凝胶侵袭实验将100μl细胞悬液接种于铺设有Matrigel凝胶的Transwell上室中,上下室血清差为10%,37℃,5%CO2饱和湿度培养箱中孵育24小时。孵育结束后擦去上室内Matrigel凝胶,将基底膜染色后,置于载玻片上进行封片。显微镜下采图并计数,分析Ajuba表达差异对细胞侵袭能力的影响。10、细胞凋亡实验将实验处理后细胞消化后,使用Annexin V/PI kit对细胞进行染色。流式细胞仪分析细胞凋亡水平变化。11、葡萄糖摄取（2-NBDG）实验将实验处理后细胞消化后重悬于含有2%胎牛血清的PBS中,加入10μΜ2-NBDG染料进行染色。使用流式细胞仪FITC通道进行分析。12、乳腺癌细胞紫杉醇耐受性实验将转染和干扰后的乳腺癌细胞经紫杉醇刺激,使用CCK8实验验证细胞活力变化:37℃,5%CO2,饱和湿度,恒温连续培养48小时,分别于24,48小时检测450nm吸光度值。处理后的乳腺癌细胞经过Annexin V/PI染色,流式细胞仪分析细胞凋亡水平变化。13、ChIP实验JASPAR网站预测TEAD4与GLUT3和Survivin启动子区的结合位点及结合序列。使用Magna ChIPA/G Assay Kit试剂盒进行CHIP实验及后续DNA纯化。纯化后DNA进行实时定量PCR检测结合位点GLUT3和Survivin的水平。SYBR Green Master Mix进行PCR荧光采集。14、统计分析统计分析使用SPSS 22.0软件。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,采用Log-rank法检验Ajuba表达差异与患者总生存之间的相关性。使用卡方检验Ajuba表达量与临床病理因素的相关性。采用Students′t方法分析实验组与对照组数据。P<0.05表示存在统计学意义。结果:1、Ajuba在乳腺癌组织中表达上调Ajuba在人类乳腺癌组织和细胞中均呈高表达。免疫组织化学结果显示,Ajuba在乳腺正常组织中呈阴性表达或弱表达,在93例乳腺癌组织中有51例（54.8%）呈阳性表达。Ajuba表达水平与乳腺癌患者的总生存呈负相关性。Western blot结果显示,Ajuba在乳腺癌细胞系中蛋白表达水平上调,尤其在三阴性乳腺癌细胞中Ajuba蛋白表达水平显著上调。2、Ajuba促进乳腺癌细胞增殖,侵袭及细胞周期转化CCK8细胞增殖实验结果显示Ajuba过表达,乳腺癌细胞增殖率提高,Ajuba表达缺失,乳腺癌细胞增殖率降低;集落形成实验结果显示Ajuba过表达增强乳腺癌细胞集落形成能力,Ajuba表达缺失抑制细胞集落形成能力。Transwell凝胶侵袭结果显示,上调Ajuba表达量,促进乳腺癌细胞侵袭的发生,下调Ajuba表达量抑制乳腺癌细胞侵袭的发生。细胞周期结果显示乳腺癌细胞中Ajuba上调,S期细胞所占百分比增加,G1期细胞所占百分比减少,使细胞在S期发生阻滞。3、Ajuba增强乳腺癌细胞对葡萄糖的摄取2-NBDG实验结果显示,Ajuba过表达后,乳腺癌细胞对葡萄糖的摄取量增加,Ajuba表达缺失后,细胞对葡萄糖的摄取量减少。4、Ajuba增强乳腺癌细胞对紫杉醇的化疗耐药性。经过Ajuba转染及干扰的乳腺癌细胞,通过紫杉醇进行凋亡诱导。CCK8结果显示,Ajuba过表达可提高乳腺癌细胞活力,Ajuba表达缺失后肿瘤细胞活力降低。流式细胞术分析细胞凋亡水平发现,上调Ajuba表达量后紫杉醇诱导的细胞凋亡水平下降,下调Ajuba表达量后紫杉醇诱导的细胞凋亡水平上升。5、Ajuba通过Hippo通路核心效应子TAZ调控乳腺癌细胞中GLUT3和Survivin的表达。上调Ajuba表达量后GLUT3、Survivin和TAZ蛋白表达水平均上调。反之下调Ajuba表达量后GLUT3、Survivin和TAZ蛋白表达水平均下调。乳腺癌中Ajuba过表达并同时敲除TAZ实验结果显示,下调TAZ表达量可逆转由Ajuba诱导的GLUT3和Survivin表达量的上调。TAZ是TEAD4的共转录激活因子,而TEAD4存在与GLUT3和Survivin启动子区结合序列,可促进GLUT3和Survivin的转录表达。结论:Ajuba在人类乳腺癌中表达上调,并与患者的总生存期呈负相关。Ajuba促进乳腺癌细胞增殖,侵袭,以及周期转化。Ajuba过表达上调葡萄糖转运蛋白GLUT3的表达,增强乳腺癌细胞对葡萄糖的摄取,促进乳腺癌细胞葡萄糖代谢过程。Ajuba增强乳腺癌细胞对紫杉醇的化疗耐药性,抑制紫杉醇引起的细胞凋亡,上调凋亡抑制蛋白Survivin的表达。Ajuba通过上调TEAD4转录辅助因子子TAZ的表达量,促进Hippo通路靶基因GLUT3和Survivin的转录表达。