锌盐固定液在病理组织标本形态学、蛋白和核酸保存效果的研究

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研究目的:探讨锌盐固定液对病理组织标本形态学、蛋白及核酸成份保存效果的影响,以探索出一种能够完整保存组织形态、又能较好地保存抗原及核酸的固定液,为组织病理诊断特别是分子病理学诊断提供更优质的样本。研究方法:1、标本:收集2015年1月至2015年12月间择期手术的肠癌、胃癌、肝癌和子宫肌瘤患者标本各10例,依据《临床技术操作规范(病理学分册)》进行取材,每例各取12块。2、实验分组:本实验分为三个实验组:锌盐固定液组,4%中性甲醛固定液组和Carnoy固定液组。固定时间为室温24h,随后按病理科常规流程处理。为了检测长期存档石蜡包埋组织中固定液对核酸保存效果的影响,每例病例均设两个时间段进行检测:新鲜处理的石蜡包埋组织和存档2年的石蜡包埋组织。3、保存效果的评价方法:⑴HE染色:从整体形态、整体染色、红细胞完整性方面评价固定液对组织形态学的保存效果。⑵酸性粘蛋白染色:使用AB染色法评价固定液对酸性粘蛋白的保存效果。⑶中性粘蛋白染色:使用PAS染色法评价固定液对中性粘蛋白的保存效果。⑷糖原染色:使用PAS染色法评价固定液对糖原的保存效果。⑸网状纤维染色:使用Gomori染色法评价固定液对网状纤维的保存效果。⑹肌纤维和胶原纤维染色:使用Masson三色染色评价固定液对肌纤维和胶原纤维的保存效果。⑺膜抗原的免疫组化染色:使用EMA、Ber-Ep4、CK8指标免疫组化染色,评价固定液对膜抗原的保存效果。⑻核抗原的免疫组化染色:使用Ki67、ER指标免疫组化染色,评价固定液对核抗原的保存效果。⑼浆抗原的免疫组化染色:使用CK、Mucin-6、Desmin、Hepatocyte指标免疫组化染色,评价固定液对浆抗原的保存效果。⑽DNA提取浓度及纯度的分析:提取新鲜的石蜡包埋组织和存档2年后的石蜡包埋组织中的DNA,测定OD260及OD260/OD280值,评价固定液对核酸浓度及纯度的保存效果。⑾DNA核酸扩增效果分析:对GAPDH基因进行PCR扩增,评价固定液对DNA完整性的保存效果。研究结果:1、固定液对整体组织形态的影响:三种固定液中,锌盐固定液在整体形态保存、整体染色效果、红细胞保存效果上与4%中性甲醛固定液相当,高于Carnoy固定液。2、固定液对特殊组织化学成份保存效果的影响:⑴对肠癌组织酸性粘蛋白,锌盐固定液的保存效果较差,不如Carnoy固定液。⑵对胃癌组织中性粘蛋白,锌盐固定液的保存效果好与Carnoy固定液相当。⑶对肝癌组织的糖原,Carnoy固定液保存效果最好,锌盐固定液的保存效果与4%中性甲醛固定液保存效果较差。⑷对肝癌组织的网状纤维,锌盐固定液的保存效果优于4%中性甲醛固定液和Carnoy固定液。⑸对子宫的肌纤维和胶原纤维,锌盐固定液与Carnoy固定液保存效果未见明显差别,好于4%中性甲醛固定液。3、固定液对抗原保存效果的影响:⑴对细胞膜抗原的保存,在肠癌组织EMA、胃癌组织Ber-Ep4以及肝癌组织CK8,锌盐固定液的保存效果较好。⑵对细胞核抗原的保存效果,在肝癌组织Ki67锌盐固定液的保存效果较好,对子宫肌瘤组织ER三组间的保存效果未见明显优势。⑶在细胞浆抗原保存效果上,除肝癌组织的Hepatocyte染色阳性率和阳性程度上,锌盐固定液优于Carnoy固定液外,其他指标的保存效果三组间未见差别。4、在短期(新鲜处理的石蜡包埋组织)保存的标本中肠癌组织、子宫肌瘤组织和长期保存的所有样本(存档2年的石蜡包埋组织)中,所提取的DNA量锌盐固定液固定组最多,但纯度三种固定液组间未见明显差别。5、对管家基因GAPDH PCR扩增效果的影响:新鲜石蜡包埋标本,三组均有清晰可见的目的DNA扩增条带;存档2年后的石蜡包埋组织,锌盐固定液组有较清晰目的条带,Carnoy固定液组目的条带较细而暗,4%中性甲醛固定液组的条带比较模糊。结论:1、在组织形态的保存和整体染色上,锌盐固定液与4%中性甲醛固定液的效果相当。在组织化学物质的保存上,锌盐固定液对中性粘蛋白、网状纤维及子宫肌纤维和胶原纤维的保存效果好。2、对细胞膜、核抗原的保存效果以及DNA含量和完整性上,锌盐固定液的保存效果好。
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