论文部分内容阅读
研究目的:探究RNA m6A去甲基酶ALKBH5(alk B homolog 5,ALKBH5)在人胰腺癌细胞株中的表达,以及其对胰腺癌细胞迁移、侵袭和上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响,并探究其作用的可能分子机制及其临床意义。研究方法:1.在ONCOMINE数据库中搜索对比正常胰腺组织和胰腺癌中ALKBH5的表达水平,研究其临床意义。采取Real-time PCR和Western blot检测ALKBH5在三种人胰腺癌细胞株中的表达。2.根据ALKBH5 sh RNA的序列,构建sh-ALKBH5干扰质粒p LKO.1-shALKBH5(sh-ALKBH5),并在m RNA和蛋白质水平鉴定其干扰效果;将ALKBH5的CDS区序列克隆至真核表达载体p3x FLAG-CMV-24,构建ALKBH5的过表达质粒3x Flag-ALKBH5,并在m RNA和蛋白水平鉴定ALKBH5的过表达效果。3.将干扰质粒sh-ALKBH5分别转入相对高表达ALKBH5的胰腺癌细胞株Pa Tu8988和相对低表达ALKBH5的SW1990中;将过表达质粒3x Flag-ALKBH5分别转入相对相对高表达ALKBH5的胰腺癌细胞株Bx PC3细胞和相对低表达ALKBH5的SW1990中,采用Transwell迁移和侵袭实验检测ALKBH5表达量对胰腺癌细胞株迁移和侵袭的影响。4.将干扰质粒sh-ALKBH5分别转入相对高表达ALKBH5的胰腺癌细胞株Pa Tu8988和相对低表达ALKBH5的SW1990中;将过表达质粒3x Flag-ALKBH5分别转入相对相对高表达ALKBH5的胰腺癌细胞株Bx PC3细胞和相对低表达ALKBH5的SW1990中,采用Western blot检测EMT主要指标蛋白、转移相关蛋白基质金属蛋白酶2(MMP2)和基质金属蛋白酶9(MMP9)及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白水平的变化;采用双荧光素酶报告基因检测实验测定细胞内β-catenin/TCF-4的转录活性。研究结果:1.在ONCOMINE数据库中搜索对比正常胰腺组织和胰腺癌中ALKBH5的表达水平,发现与正常胰腺组织相比,胰腺癌中ALKBH5的表达水平下降。ALKBH5差异性表达于3种胰腺癌细胞株,在Pa Tu8988细胞和Bx PC3细胞中表达相对较高,SW1990中ALKBH5的表达水平相对较低。2.菌液PCR及上海生工测序鉴定结果表明,sh-ALKBH5和3x Flag-ALKBH5质粒构建成功。本实验所构建的sh-ALKBH5质粒能够有效地抑制胰腺癌Pa Tu8988和SW1990细胞中ALKBH5的表达;本实验所构建的3x Flag-ALKBH5质粒能够高效地在SW1990和Bx PC3细胞中表达ALKBH5。3.与对照组对比,下调ALKBH5的表达后,Pa Tu8988和SW1990细胞的迁移及侵袭能力增强。相反,上调ALKBH5的表达后,SW1990和Bx PC3细胞的迁移及侵袭能力均减弱。4.下调ALKBH5的表达后,Pa Tu8988和SW1990细胞的EMT能力增强,MMP2和MMP9的蛋白表达水平增多,抑制GSK-3β的活性从而抑制β-catenin的磷酸化,细胞内β-catenin积聚,激活Wnt/β-catenin信号通路以及促进胰腺癌细胞内的β-catenin/TCF-4的转录活性;相反,上调ALKBH5的表达后,SW1990和Bx PC3细胞的EMT能力减弱,MMP2和MMP9的蛋白表达水平减少,增强GSK-3β的活性从而促进β-catenin的磷酸化,导致细胞内β-catenin减少,抑制Wnt/β-catenin信号通路以及抑制胰腺癌细胞内的β-catenin/TCF-4的转录活性。研究结论:1.ALKBH5通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制胰腺癌细胞迁移、侵袭和上皮间质转化的生物学功能,具体作用机制需要更深入的研究。2.ALKBH5在胰腺癌细胞中迁移、侵袭和上皮间质转化的生物学功能中扮演抑癌基因的角色。