研究背景及目的:肺癌是人类发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,非小细胞肺癌(NSCLC)是其最主要的病理类型。超过40%的NSCLC患者初诊即为进展期,不适于手术治疗。尽管放化疗、靶向治疗和免疫治疗等治疗手段已取得重要进展,但是肺癌复发与转移仍然是治疗的瓶颈,寻找新疗法阻断肺癌复发和转移已成为当前的迫切需求。肿瘤血管形成是肿瘤生长、侵袭和转移的关键因素,血管拟态是肺癌血管形成的重要形式。血管拟态是由高侵袭性肿瘤细胞模拟内皮细胞形成功能性血管样结构的形式,近年来,已被报道与肺癌抗血管药物耐药性、肺癌患者不良预后密切相关。然而,血管拟态的调控机制尚不清楚,针对血管拟态的特异性阻断方法更是缺乏。因此,探索肺癌细胞血管拟态的分子机制及拮抗手段,对于防治肺癌细胞生长、复发和转移从而改善患者预后具有重要的理论价值和实践意义。Celecoxib是一种环氧化酶2(COX-2)选择性抑制剂,具有抗炎、抗肿瘤生长、抑制血管新生、以及增敏放化疗的作用。我们尝试使用Celecoxib抑制肺癌细胞血管拟态,发现Celecoxib能够抑制肺癌血管拟态,并与COX-2表达无直接关系,可能存在其他的作用靶点。近年研究也显示,Celecoxib的抗肿瘤作用可不依赖于COX-2,存在脱靶效应(off-target effect)。我们推测,Celecoxib可能作用于COX-2以外的分子靶点,从而阻断肺癌血管拟态。研究方法:1.Celecoxib对肺癌细胞血管拟态的作用选取3株肺癌细胞株(A549、H1650和H460),在三维Matrigel基质胶中观察肺癌细胞形成管状结构的情况,PAS染色验证其血管拟态(vasculogenic mimicry,VM)特征;5Gy放射线作用于肺癌细胞株,观察其在Matrigel基质胶中的管状结构形成能力;在培养基中加入一定浓度的环氧合酶(COX-2)抑制剂Celecoxib,24小时后,重复Matrigel基质胶成管实验,探讨Celecoxib对肺癌细胞血管拟态的影响。2.生物信息学方法预测Celecoxib的新靶点选取Qiagen公司的血管新生基因芯片数据库,包括84个参与血管新生的关键基因,将这些血管新生相关蛋白作为Celecoxib新靶点分析的分子库。在Uni Prot和PDB数据库中检索并筛选蛋白3D结构,在Pub Chem数据库中下载Celecoxib结构。用MGLTools 1.5.6软件处理受体蛋白与配体小分子结构,保存为pdbqt文件。以蛋白中心某个原子为中心设置对接盒子,用Autodock_vina 1.1.2作为分子对接工具,计算Celecoxib与每个蛋白受体的结合位点和亲和力,搜索前20个最佳结合位点。用PLIP计算结合位点与Celecoxib相互作用的残基详情。选取亲和力高的蛋白比较其与已知抑制剂结合位点以及与Celecoxib的结合位点,证实配受体间是否有功能性结合。3.Celecoxib新靶点的初步验证将生物信息学方法预测出的与Celecoxib功能性结合的潜在新靶点,包括APN、AKT1、ITAV(基因为ITGAV)和NOS3,进行实验验证。由于未能购买到NOS3抗体,我们以APN、AKT1、ITAV为研究对象,并将COX-2作为对照分子。(1)利用荧光光谱技术,将Celecoxib与4种蛋白(APN、AKT1、ITAV、COX-2)混合,用多功能酶标仪测定混合物的同步荧光光谱及其在不同温度(25°C、29°C、32°C)下的荧光猝灭光谱,通过荧光猝灭特征,推断Celecoxib与蛋白的直接结合能力。(2)在3株肺癌细胞株(A549、H1650和H460)中,检测APN、AKT1、ITAV、COX-2的表达差异;在5Gy放射线作用下,检测三株肺癌细胞中APN、AKT1、ITAV、COX-2表达变化;在Celecoxib作用下,检测三株肺癌细胞中APN、AKT1、ITAV、COX-2表达变化。(3)选用5周龄雌性BALB/c裸小鼠,将肺癌细胞株经皮下注射,建立肺癌移植瘤小鼠模型,随机分为4组(亲本细胞对照组、Celecoxib组、放射治疗组、放射治疗+Celecoxib组);放射线处理为肿瘤局部给予15Gy X线(320KV)照射,Celecoxib处理为灌胃给予Celecoxib。切除肿瘤组织,经免疫荧光双染(m CD31和h E-cad)和PAS染色观察血管拟态形成情况。研究结果:1.Celecoxib抑制肺癌血管拟态不同肺癌细胞株(A549、H1650和H460)在Matrigel基质胶中均能形成管状结构,PAS染色呈阳性,显示其具有血管拟态特征;在5Gy剂量放射线作用下,肺癌细胞血管拟态形成能力显著增强(P<0.01);在Celecoxib作用下,血管拟态完全消失。而该现象与COX-2的表达关系不密切。2.Celecoxib与4种血管新生蛋白有功能性结合84个血管新生蛋白数据库中,54个蛋白具有明确的3D结构。与Celecoxib进行分子对接,结果显示,14个蛋白与Celecoxib结合自由能低于-8.0 kcal/mol,具有较高亲和力;6个蛋白结合自由能低于-9.0 kcal/mol,具有高亲和力;1个蛋白结合自由能低于-10.0 kcal/mol,具有更高亲和力。进一步分析Celecoxib与潜在靶蛋白及其抑制剂的结合能,模拟比较结合位点,结果显示Celecoxib与4个蛋白(APN、AKT1、ITAV、NOS3)存在功能性结合,也包括COX-2。3.Celecoxib作用于3个血管新生新靶点荧光光谱分析显示,随着Celecoxib浓度升高,其与3种蛋白(AKT1、ITAV和COX-2)混合物的荧光强度逐渐减弱;随着温度升高,混合物荧光强度逐渐增强,表明Celecoxib与3种蛋白(AKT1、ITAV和COX-2)均有直接相互作用。随着培养基中Celecoxib浓度的增加,4种基因(APN、AKT1、IGTAV和COX-2)表达均受到Celecoxib的抑制;不同细胞株中,放射线诱导不同基因(APN、AKT1、IGTAV)的表达上调,Celecoxib可显著抑制APN、AKT1和IGTAV的表达。动物实验显示,移植瘤组织中血管结构显示为小鼠血管内皮显色(m CD31阳性)和人肺癌细胞显色(h E-cad阳性),存在血管拟态(嵌合血管);放射线可增强该效应,而Celecoxib可阻断该效应。结论:1.肺癌细胞具有血管拟态特性,放射线可增强该效应,而Celecoxib可阻断该效应,其阻断作用与COX-2表达水平关系不密切。2.除COX-2之外,Celecoxib可不同程度地直接作用于3个血管新生蛋白(APN、AKT1、ITAV),是一种非COX-2依赖的脱靶效应。3.不同肺癌细胞株中,放射线可不同程度诱导APN、AKT1、ITAV的表达,Celecoxib可阻断肺癌细胞血管拟态,增强肺癌放射线敏感性,是Celecoxib抗肿瘤效应的新发现。4.通过分子拟合方法,预测Celecoxib“脱靶效应”的血管新生分子靶点,并在体内外实验中进行证实,具有重要的理论价值,具有“老药新用”的应用前景。