酿酒酵母全细胞催化合成S-腺苷蛋氨酸的研究

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S-腺苷蛋氨酸(SAM)是一种涉及能量偶联的生物活性物质,其广泛的临床用途已得到普遍的认可。目前工业大规模生产中大多采用发酵的方法,但是该方法一般仅仅利用葡萄糖的代谢途径供给ATP,ATP产生效率不是很高;且发酵结束以后需将SAM从胞内抽提出来,在此过程中会使用大量的有机溶剂,对环境造成污染,且易引入胞内的其他杂质,加大了后续分离过程的难度。而酶促转化法是利用腺苷蛋氨酸合成酶[EC2.5.1.6]催化腺苷三磷酸(ATP)和甲硫氨酸(L-Met)来合成SAM。由于其反应产物纯度高、分离提纯容易、反应周期短、无污染等特点越来越受到研究者的关注。但是由于ATP的外源供给代价过高而使得工业化成本偏高。   由于微生物全细胞酶系丰富,稳定性好,用其进行酶催化反应还可以避免将酶从微生物细胞中提取出来的步骤。本文利用有透性的酿酒酵母休止细胞作为生物催化剂,以腺苷和L-Met作为底物,将腺苷底物磷酸化积累ATP与SAM合成酶催化ATP和L-Met生成SAM这两个反应相偶联,成功实现了高效的ATP原位再生与利用,合成了SAM。新型渗透剂15的添加,使得酿酒酵母细胞合成SAM的能力有了很大的提升,SAM合成时间约缩短了2h;细胞经冷冻贮藏和渗透剂处理之后,SAM的合成量从1.34g/L提高到2.77g/L;此外经促渗透化处理后的细胞能很好的释放胞内代谢的极性物质,产物释放率达98%。   本文讨论了金属离子和小分子效应物对SAM合成的影响及关键酶活的调控作用。发现两种主要的金属离子Mg2+,K+的存在对整个反应途径中的酶的活性至关重要。且两者的最佳浓度分别为0.18mol/L和0.15mol/L。而添加甘油、乙醛和维生素E等小分子物质,对合成SAM均有较强的正效应,相比没有添加此类小分子物质的反应,SAM的产量分别上升了36%,24.5%和17.6%。   最后,采用部分析因和响应面设计优化实验,SAM合成量达到5.05 g/L,实际产率为37.7%,相较于单因素提高了20.8%。
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